【正文】 完整的生化反應網(wǎng)絡就是代謝工程必須要考察的，重視代謝網(wǎng)絡和目標產(chǎn)物的熱力學可行性、代謝流及其控制。 代謝工程的實質： 對代謝網(wǎng)絡進行定量分析，并在此基礎上進行代謝改造（代謝網(wǎng)絡重構），以最大限度地提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率 代謝工程設計的主要內容包括： ① 生物合成相關代謝調控 和代謝網(wǎng)絡理論； ② 代謝流的定量分析； ③ 代謝網(wǎng)絡的重新設計； ④ 中心代謝作用機理及相關代謝分析； ⑤ 基因操作 。 代謝工程通過對特定的生化反應的遺傳基礎進行修飾或用重組 DNA技術導入新的生化反應來改進蛋白質分子的性質。 研究手段： 代謝工程注重酶學、化學計量學、分子反應動力學以及現(xiàn)代數(shù)學的理論及技術為研究手段，在細胞水平上闡明代謝途徑與代謝網(wǎng)絡之間局部與整體的關系、胞內代謝過程與胞外物質運輸之間的偶聯(lián)以及代謝流流向與控制的機制，并在此基礎上通過工程和工藝操作達到優(yōu)化細胞性能的目的。 這標志著代謝工程作為一門學科的誕生 。 ，利用基因克隆改變代謝流，擴展和構建新的代謝途徑，盡可能最大限度地提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，已取得令人矚目的成果。 ，應用基因突變來改造微生物原有的調節(jié)系統(tǒng)。 ，活細胞這種自身固有的代謝網(wǎng)絡的遺傳特性并不是最佳的。 假如用己烷進行內部溶劑萃取時，因為在發(fā)酵系統(tǒng)中加入揮發(fā)性溶劑，會導致傳氧困難，即便細胞處于產(chǎn)物合成的旺盛期也會減少產(chǎn)物的生成，即所謂的“相毒性” (phase toxocity)。◇ 25g/L t 5. PHAs分批發(fā)酵動力學 (1)細胞生長動力學 ))/(1(/ NCNC ssssss ????C / N 對細胞生長速率的影響○為實驗值，曲線代表模型計算值 (2) PHAs形成模型 RR xdtdxdtdp ??t /hPH As 積累與模型計算值的比較○為實驗值，曲線代表模型計算值 6. 以有機廢水酸化產(chǎn)物為底物進行 PHAs流加發(fā)酵 （ 1）流加發(fā)酵過程曲線 將 UASB出水中的總有機酸濃度濃縮至 150 g/L左右，進行 PHAs生產(chǎn)的 流加發(fā)酵，發(fā)酵結果見圖 t / h度濃量質的質物各流加發(fā)酵過程中 DC W 、 P HA s 、 NH 4 + 、有機酸的濃度變化□ DCW ； P HA ；? 丁酸；● 乙酸；? 丙酸；■ NH 4 + (2)酸化廢水發(fā)酵過程中丁酸對 PHAs的產(chǎn)率的變化 酸丁發(fā)酵時間酸丁發(fā)酵時間分批發(fā)酵過程中丁酸對 P H A s 的產(chǎn)率變化流加發(fā)酵過程中丁酸對 P H A s 的產(chǎn)率變化 四 . 生物反應與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng) 生物反應與分離 (或分配 )相組合的技術： 選擇性地從培養(yǎng)液中連續(xù)分離有抑制性、有毒性或不穩(wěn)定性產(chǎn)物，或者將底物以一種可控的方式添加到培養(yǎng)液中，對生物反應過程都能產(chǎn)生極大的促進作用 生物反應與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)也稱為原位 (in situ)產(chǎn)物分離過程或提取生物轉化，即在生物反應發(fā)生的同時，選擇一種合適的分離方法及時將對生物反應有抑制或毒害作用的產(chǎn)物或副產(chǎn)物選擇性地從生產(chǎn)性細胞或生物催化劑周圍移走 生物反應與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)具有如下三個特征： (1)耦合過程是一種集成式單元操作，其生物反應器具有特殊的結構 (2)實現(xiàn)產(chǎn)物及時分離的方法有很多，但必須考慮產(chǎn)物的特性及具體的生物反應體系來合理選擇和設計 (3)耦合過程作為一種新的反應工程技術，可適用于各種生物反應過程 分離技術的選擇主要基于四個方面的因素： (1)分離技術應當具備生物相容性，適宜的分離技術應當對生物反應不造成負面影響，不會造成生物催化劑或細胞的失活、變性和死亡，也不會改變生物反應的代謝和調節(jié)機制； (2)應當考慮產(chǎn)物或副產(chǎn)物的物理化學特性和生物學特性； (3)考慮系統(tǒng)的流體特性，因為流體力學性質決定并影響分離過程的傳質，從而影響分離的容量和速度，如高粘度的非牛頓型流體就不能用膜分離技術；(4)考慮工程及經(jīng)濟因素，理想的分離技術應當是操作費用低、性能穩(wěn)定、工程上易于實現(xiàn)的技術 1. 隨程溶劑萃取 ? 包括內部隨程萃取和外部隨程萃取兩種方式 (1) 內部隨程萃取是指萃取劑在反應器中與培養(yǎng)基直接接觸，以便將產(chǎn)物萃取到溶劑中去 (例如，在利用帚狀地霉發(fā)酵生產(chǎn)酯類風味物質的研究中，內部溶劑萃取技術得到了很好的應用 ) ? 內部溶劑萃取的特點是 ∶ 溶劑和液相混合均勻，因而有利于傳質的進行；但溶劑也可能在培養(yǎng)液中形成穩(wěn)定的乳化作用，這對溶劑與產(chǎn)物的分離不利 (2) 外部隨程萃取是指萃取劑和培養(yǎng)液在反應器外的萃取裝置中逆流接觸，從而萃取產(chǎn)物的過程 164。 ? 15 g/L。 代謝方程分別為 ∶ C6H12O6 + 4H2O→2CH 3COO + 2HCO3 + 4H+ + 4H2 C6H12O6 + 2H2 →2CH 3CH2COO + 2H2O +2H+ C6H12O6 + 2H2O →CH 3CH2CH2COO + 2HCO3 +3H+ +2H2 C6H12O6 →2CH 3CHOHCOO + 2H+ (2) 有機酸合成 PHAs的代謝途徑 ? R. eutropha 利用小分子有機酸合成的 PHAs主要為聚羥基丁酸 (PHB)、羥基丁酸和羥基戊酸的共聚物 (PHBV) ? 以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸為碳源時 PHAs的合成途徑 : 2 . 3 酮硫解酶4 . P H B 合成酶3. 乙酰乙酰 C o A 還原酶1. 硫激酶乙酰 C o A乙酰乙酰 C o A3 羥基丁酰 C o AC o A S H N A D P HN A D PC o A S HP H BC o A S H乙酸1 234丙酸 丙酰 C o A 3 酮戊酰 C o A 3 羥基戊酰 C o A乙酰 C o A 乙酰乙酰 C o A 3 羥基丁酰 C o AP HB VCO 2C o AS H1. 硫激酶 酮硫解酶 3. 乙酰乙酰 C o A 還原酶 4. 脫羧酶系 HB V 合成酶124 5NADNADH3NADNADH3C o AS HC o AS H2 NAD NADH乳酸 丙酮酸乙酰乙酰 C o AC o AS HNADH乙酰 C o ACO 21. 脫氫酶 HB 合成酶2. 丙酮酸脫氫酶復合體4. 乙酰乙酰 C o A 酮硫解酶3 羥基丁酰 C o AP HBC o AS HNA DP HNADP1 2345NAD丁酸 丁酰 C o A 2 烯丁酰 C o AA TP A M P + 2 P iC o A S HF A D 2F A D HH O21. 硫激酶 2. 脫氫酶 3. 水化酶 4. 聚合酶H O23 羥基 丁酰 C o A( D 型 )P H BC o A S H3 羥基丁酰 C o A( L 型 )3 酮 丁酰 C o AN A D N A D H1 2 34 (3)不同有機酸對 PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較 不同有機酸對 PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較 一步法碳源 N AD P H 再生 P H As Yp ct h eo r/( )/ g ? g 1Yp c/Y c e ll c/兩步法Yp c/乙酸 異檸檬酸 P H B 0. 48 0. 12 0. 24 0. 27丙酸 異檸檬酸 P H B V 0. 58 ～ 0. 68 0. 18 0. 19 0. 32乳酸 不需要 P H B 0. 48 0. 19 0. 16 0. 33丁酸 異檸檬酸 P H B 0. 65 0. 32 0. 14 0. 41 在一步發(fā)酵法中，由于所消耗的有機酸有一部分用于合成細胞的合成，因而四種有機酸對 PHAs的實際產(chǎn)率均小于兩步法，但它們對 PHAs和細胞的產(chǎn)率之和卻大于兩步法的產(chǎn)率 (4) 產(chǎn)酸相產(chǎn)物分布及其影響因子的研究 (a) HRT對酸化產(chǎn)物分布的影響 度濃酸機有丙酸乳酸丁酸乙酸HRT對酸化產(chǎn)物分布的影響 (b) 不同 pH條件下 UASB反應器出水產(chǎn)物分布 pH度濃量質酸水出U A S B 反應器中 pH 值對出水酸分布的影響 丁酸 乙酸 丙酸 乳酸 4. 不同初始酸濃度對 PHAs發(fā)酵過程的影響 t不同初始酸濃度對 細胞干重 的影響初始酸濃度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L當硫酸銨濃度為 ，初始酸濃度在 20g/L左右較佳 ta c e ti c a c i dtbu tyr ic aci dpr op i on i c aci d乙酸、丁酸和丙酸濃度與發(fā)酵時間的關系初始酸濃度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L丁酸消耗速率大大超過乙酸和丙酸的消耗速率 , 當初始酸濃度為 5 、 1 20和 25 g/L時，最終發(fā)酵液中殘留的丁酸濃度為 ∶ 0、 、 、 PHAs濃度的變化 殘留細胞量隨時間的變化 初始酸濃度 : ○ 5 g/L。 PHAs合成階段初始細胞干重為 g/L，細胞中無 PHAs積累 t /h發(fā)酵過程中菌體干重的變化碳源為∶ ，丁酸； ，乳酸； ，丙酸； ，乙酸t(yī) /hP H A s 的積累過程碳源為∶ ，丁酸； ，乳酸； ，丙酸； ，乙酸 (3) R. eutropha WSH1利用混合酸發(fā)酵 PHAs 初始酸濃度 10 g/L(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各 g/L)，發(fā)酵 41 h和 57 h分別加入 8 g/L的混合酸 (乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各 2 g/L) 結論：在生長和合成 PHAs階段對有機酸的利用順序皆為 丁酸 乳酸 丙酸 乙酸 重干胞細A+t /h度濃酸Bt /h發(fā)酵過程中細胞干重 ( ) 、 P H A ( ) 和 NH 4 + 濃度 ( ) 的變化發(fā)酵過程中乙酸 ( ) 、丙酸 ( ) 、乳酸 ( ) 和丁酸 ( ) 濃度的變化 3. 有機廢水生產(chǎn) PHAs的機理研究 (1) 廢水中大分子物質轉化為小分子有機酸 厭氧微生物己糖降解最重要的代謝途徑是 EMP和 HMP途徑，先生成丙酮酸，然后形成揮發(fā)性有機酸、乳酸等。此階段的細菌種類多，代謝能力強，繁殖速度快。其中聚 ?羥基丁酸 (簡稱PHB)及 3羥基丁酸與 3羥基戊酸的共聚物 (簡稱 P(3HBco3HV)或 PHBV)是 PHAs族中研究和應用最廣泛的兩種多聚體 ? PHAs作為一種有光學活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如質輕、彈性、可塑性、耐磨性、抗射線等外，更重要的是其還具有生物可降解性和生物可相容性。 塑料制品種類繁多 ， 難以分揀回收 ? (5)對生態(tài)環(huán)境危害大 。由于價廉 、 易老化 ， 塑料用量的增加導致其廢棄物也迅速增加 ， 傾入海洋的塑料垃圾達數(shù)十萬噸 ， 陸上的更是難以計數(shù) ? (3)處理困難 。 江河湖泊 ， 田野山川無處不有 ? (2)污染物增長量快 。肌苷酸鈉鹽 )的生產(chǎn)過程 ? Inosine(肌苷 )＋ ATP→IMP ＋ ADP ? （ 2） CDP(胞苷二磷酸 )膽堿的生產(chǎn)過程 ? 氯化膽堿＋ ATP→ 磷酸膽堿＋ ADP ? CTP＋磷酸膽堿 → CDP膽堿 ? 在 （ 1）和（ 2）中均采用重組 E. Coli和產(chǎn)氨短桿菌 ? （ 3） GSH的生產(chǎn)過程 ， 可采用兩種系統(tǒng)： ? 共固定化系統(tǒng) (S. cerevisiae和 E. coli細胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝膠中 )和混合固定化系統(tǒng) (S. cerevisiae和 E. coli分別用聚丙烯酰胺凝膠固定化后再混合使用 ) 6. ATP再生系統(tǒng)存在的問題 ? （ 1） 除了合成產(chǎn)物所需的關鍵酶以外 ，細胞內還有許多種酶 ， 其中一些具有分解活性 ， 能將反應的底物和預定的產(chǎn)物轉化為副產(chǎn)物 ? （ 2） 微生物細胞具有很強的自我保護功能 ， 作為滲透屏障的細胞膜可防止胞內物質滲出 。鳥苷酸鈉鹽 )生產(chǎn)過程 ? XMP＋ NH3＋ ATP→ GMP＋ AMP＋ PPi ? （ 2） ATP(腺嘌呤核苷 539。系統(tǒng)必須適應外部環(huán)境的變化，能夠經(jīng)常與外部環(huán)境保持最佳的適應狀態(tài)，才能得以