【正文】 影響 H的因素：培養(yǎng)基的厚度 ?細(xì)菌生長到肉眼可見所需的時間 T越大在其它條件相同時， r越大 影響 T的因素：菌體本身，及影響菌體生長的條件如：接種量，培養(yǎng)溫度、及營養(yǎng)環(huán)境 其它影響因素：上層鋪得平整、菌液加入時的溫度、鋼圈的放置、滴液 。測得抑菌圈后，將濃度和抑菌圈平均直徑做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 假設(shè)選用的濃度為： 3U， 4U，5U， 6U,7U 中心點(diǎn)是 5U 1 1 2 2 2022/5/30 89 每個濃度做三個碟子。l o g 2 DT HCSDTm L ????)4l o g () 1(l o g 2 DT HCUDTm L ??????MM 39。兩劑量法： 標(biāo)準(zhǔn)品低單位 總量 :m 抑菌圈半徑 SL 標(biāo)準(zhǔn)品高單位 總量 :M 抑菌圈半徑：SH 樣品高單位 總量 :M’ 抑菌圈半徑 UH 樣品低單位 總量 :m’ 抑菌圈半徑： UL )4l o g () 1(l o g 2 DT HCSDTM H ????)4l o g () 1(39。此外還受 C、 H、 D、T的影響 但是 C、 H、 D、 T是無法測量的，在實(shí)際計(jì)算中要設(shè)法消去 2022/5/30 84 一般的消去方法有 ?二劑量法 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2022/5/30 85 KmMmM ??39。隨著抗生素濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就叫“抑菌圈”。 2022/5/30 81 在培養(yǎng)基表面垂直放上小杯，在杯中加入待檢樣品，加滿后在 370C培養(yǎng) 16~18小時。 操作方法是：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟 15ml（下層），待其凝固。 生物法 2022/5/30 80 常用的生物法測定抗生素，采用 杯碟法 “杯”（牛津杯）是放被測抗生素的不銹鋼小管，小管內(nèi)徑為 6mm，高 10mm的圓筒形管子，管子的重量盡可能相等。但此法得到結(jié)果比較慢，需經(jīng)過 16~18小時培養(yǎng)。 谷氨酸 ?????? ?? 谷氨酸脫氫酶 γ－氨基丁酸＋ CO2 2022/5/30 79 化學(xué)和物理方法優(yōu)點(diǎn)：快速、方便，經(jīng)常用于過程分析 缺點(diǎn)產(chǎn)品中存在的雜質(zhì)會干擾測定結(jié)果，因此抗生素成品的測定用生物法測定。 2022/5/30 78 （ 3）測壓法 產(chǎn)物特定反應(yīng)放出或攝入氣體，使系統(tǒng)有壓力變化，可以通過測定壓力變化得知產(chǎn)物量。 2022/5/30 76 （二） 產(chǎn)物量的測定 化學(xué)法 （ 1）滴定法 產(chǎn)物能使一定指示劑變色來指示反應(yīng)終點(diǎn)的可用滴定法 如青霉素在堿性條件下加入過量的 I2，反應(yīng)生成青霉噻唑酸碘，用 Na2S2O3滴定多余的碘，可計(jì)算出青霉素的單位 2 2 3 22, N A S O IO H I??????? ??????? 滴定多余過量青霉素 青霉噻唑酸碘 計(jì)算青霉素效價(jià)檸檬酸可以用 NaOH滴定來計(jì)算檸檬酸產(chǎn)量 2022/5/30 77 （ 2）比色法 產(chǎn)物經(jīng)一定化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色，且顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，可以用比色法測定。由于酶通常不是很純，不能用重量來表示酶的量。而且通過計(jì)算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補(bǔ)料、 pH對產(chǎn)物形成的影響。補(bǔ)料會引起菌濃的波動，這也是衡量補(bǔ)料量適合與否的一個參數(shù)。 一 發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目 2022/5/30 66 菌濃度和菌形態(tài) 菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長的情況。 磷是核酸的組成部分，是高能化合物ATP的組成部分，磷還能促進(jìn)糖代謝。 發(fā)酵后期氨基氮回升，這時就要放罐，否則影響提取過程。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。 氮利用快慢可分析出菌體生長情況，含氮產(chǎn)物合成情況。如氨基酸中的氮，黃豆餅粉、花生餅粉中都有有機(jī)氮。 還原糖 指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。 總糖 指發(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。通過糖含量的測定，可以控制菌體生長速率，可控制補(bǔ)糖來調(diào)節(jié) pH，促進(jìn)產(chǎn)物合成，不致于盲目補(bǔ)糖，造成發(fā)酵不正常。 一 發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目 排氣氧、排氣 CO2和呼吸熵 2022/5/30 63 糖含量 微生物生長和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關(guān)系。對于這種工藝，后期的補(bǔ)料控制是關(guān)鍵。 一 發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目 2022/5/30 61 RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長階段的不同而不同。 2022/5/30 58 第二節(jié) 發(fā)酵過程的中間分析 一 發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目 二 產(chǎn)物量的測定 2022/5/30 59 一 發(fā)酵過程主要分析的項(xiàng)目 目前發(fā)酵過程主要分析項(xiàng)目如下 pH pH與微生物的生命活動密切相關(guān) —— 酶催化活性 pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映 ——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況 2022/5/30 60 排氣氧、排氣 CO2和呼吸熵 排氣氧 的濃度表征了進(jìn)氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長的活性，通過計(jì)算可以求得攝氧率（ OUR）。因?yàn)槲⑸飩€體極微小，肉眼無法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。 一般來說微生物在不同體積的反應(yīng)器中的生長速率是不同的 ，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空氣停留時間和分布不同，剪切力不同，滅菌時營養(yǎng)成分破壞程度不同所致。 2022/5/30 50 全參數(shù)發(fā)酵罐除了裝備有常規(guī)發(fā)酵罐的溫度、溶氧、 pH電極，得到發(fā)酵全過程的這些參數(shù)外，還有罐體稱重，補(bǔ)料計(jì)量裝置和尾氣采集分析系統(tǒng)，更重要的是，有一套獨(dú)特的數(shù)據(jù)處理軟件，軟件的開發(fā)是長期科研成果的結(jié)晶，可以得到多個發(fā)酵過程參數(shù)，并且可以輸入和繪制人工測定的參數(shù)，對發(fā)酵過程的分析起到了重要的作用 2022/5/30 51 教材 P185 2022/5/30 52 鳥苷發(fā)酵過程曲線 2022/5/30 53 生產(chǎn)規(guī)模放大 ： 在大型發(fā)酵罐規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。 2022/5/30 49 代謝及工程參數(shù)層次研究 ： 一般在小型反應(yīng)器規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。主要考察目的菌株生長和代謝的一般條件，如培養(yǎng)基的組成、最適溫度、最適 pH等要求。 但對于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確性高，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的最佳條件是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法算出來的，如果實(shí)驗(yàn)中存在較大的誤差就會得出錯誤的結(jié)果。 優(yōu)點(diǎn) 同時進(jìn)行多因子試驗(yàn)。 缺點(diǎn) 如果考察的條件多，實(shí)驗(yàn)時間會比較長 各因子之間可能會產(chǎn)生交互作用，影響結(jié)果準(zhǔn)確性 2022/5/30 47 數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到最佳的實(shí)驗(yàn)條件。 2022/5/30 46 三 發(fā)酵過程研究的方法和層次 研究方法 單因子實(shí)驗(yàn) ：對實(shí)驗(yàn)中要考察的因子逐個進(jìn)行試驗(yàn)，尋找每個因子的最佳條件。因此發(fā)酵過程的控制具有不確定性和復(fù)雜性。 2022/5/30 44 微生物的生長與產(chǎn)物合成有密切相關(guān)性，不僅表現(xiàn)在菌體量的大小影響產(chǎn)物量的多少，而且菌體生長正常與否，即前期的代謝直接影響中后期代謝的正常與否。 在長時間的培養(yǎng)過程中 ， 微生物菌種容易發(fā)生變異 ， 發(fā)酵過程易染菌； 新加入的培養(yǎng)基與原有的培養(yǎng)基不易完全