【正文】 九 結(jié)論 ： 十 再驗證周期 國家相關(guān)微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)修改后需要對本方法重新進行再驗證。 七 異常情況處理 嚴(yán)格按照《微生物限度檢查法 SOP》操作，如在檢測中有不符合要求的情況出現(xiàn)，分析問題原因后，決定是否需對本方案中設(shè)定的微生物限度檢查方法進行修改，并重新進行驗證。 菌數(shù)報告規(guī)則 若濾膜上無菌落生長，以 1 報告菌數(shù)，或 1 乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌落數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌，玫 瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點計霉菌和酵母菌，細(xì)菌菌落數(shù)。若同稀釋級別兩個平板的菌落平均數(shù)不小于 15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。 備注：以上各菌懸液中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌用 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 作為細(xì)菌計數(shù)； 白色念珠菌和黑曲霉 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng) 作為霉菌酵母菌計數(shù)。每株試驗菌平行制備 2個平皿， 按平皿菌落計數(shù)法測定其細(xì)菌數(shù) 稀釋劑對照組： 用相應(yīng)的稀釋液即 無菌氯化鈉 蛋白胨緩 沖液代替供使品，加入各試驗菌 1ml，按實驗組供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù) 。 菌液組： 分別取上述 5 種試驗菌懸 驗菌平行制備 2 個平皿，按平皿菌落計數(shù)法測定其菌數(shù)。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管內(nèi)，用含 %（ ml/ml）聚山梨酯 80的 ％無菌氯化鈉溶液 10 倍稀釋 105制成每 1ml 含菌數(shù)為 50～ 100cfu 的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。 取新鮮的白色念珠菌的培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中， 經(jīng) ℃培養(yǎng) h，用 ％無菌氯化鈉溶液 10 倍稀釋 105制成每 1ml含菌數(shù)為 50～ 100cfu 的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。 枯草芽孢桿菌 CMCC(B) 6350金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 2600大腸埃希菌 CMCC（ B） 4410白色念珠菌 CMCC (F) 9800 黑曲霉 CMCC(F)98003。若試驗組的 菌回收率均不低于 70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌；若任一次試驗中實驗組的菌回收率低于 70%，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。 二 目的 建立該純化水的微生物限度檢查方法 ，并對其有效性進行評價，確保試驗方法的完整性，保證檢驗結(jié)果的可靠性。 附表一 題目 微生物限度檢查法純化水驗證 報告 編號 起草人 審核人 批準(zhǔn)人 日期 日期 日期 頒發(fā)部門 質(zhì)量管理部 生效日期 制作備份 分發(fā)部門 質(zhì)量保證 室、 質(zhì)量控制 室 版本： 1 一 概述 本驗證是對細(xì)菌，霉菌酵母菌 計數(shù)項下檢查法 2 薄膜過濾法進行細(xì)菌，霉菌及酵母菌的計數(shù)方法驗證。 八 測試結(jié)果 細(xì)菌、霉菌 及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果見附表 1，此表三份次數(shù)分別為 3次。 計算回收率： 試驗組的菌數(shù)回收率（ %）＝（實驗組的平均菌落數(shù) — 供試品對照組的平均菌落數(shù)） /菌液組的平均菌落數(shù) 100% 稀釋劑對照組的回收率（ %）＝ (稀釋劑對照組平均菌落 /菌液組平均菌落數(shù)數(shù) ) 100% 判斷標(biāo)準(zhǔn)： 本次試驗各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均應(yīng)不低于 70%。然后將營養(yǎng)瓊脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為計數(shù)結(jié)果。 一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。 培養(yǎng)和計數(shù) 以上各組中做細(xì)菌計數(shù)的平皿與 3035℃倒置 培養(yǎng) 3 天，霉菌、酵母菌與 2328℃倒置培養(yǎng) 5 天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至 5～ 7 天進行菌落計數(shù)報告。 陰性對照組：取實驗用的稀釋液 1ml，制備濾膜，濾膜菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，均不得有菌生長。 試驗組： 取供試液 1ml，過濾，沖洗，分別在最后一次的沖洗液中加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、入白色念珠菌和黑曲霉試驗菌懸液各 1ml，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。 、霉菌及酵母菌的計數(shù)方法驗證試驗 供試品對照組： 用滅菌注射器取少量 無菌氯化鈉 蛋白胨緩沖液注入滅菌薄膜過濾器，潤濕濾膜，再取充分混勻的純化水樣 1ml 注入濾器，再用適量的 無菌氯化鈉 蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，使總沖洗量為 100ml,沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于已制備好的平板上， 按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)；細(xì)菌、霉菌及酵母菌各制備 2 個平皿?！媾囵B(yǎng) 5～ 7d，加入 3～ 5ml 含 %（ ml/ml）聚山梨酯 80 的 ％無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。 ℃培養(yǎng) 24～ 48h，用 ％無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 50～ 100cfu 的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。 ℃培養(yǎng) 18～ 24h，用 ％無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 50～ 100cfu 的菌懸