【正文】 。用水洗，然后定影。可以4張膠片一起曝光。去除多余的ECL，將保鮮膜覆蓋于膜上，避免產(chǎn)生氣泡。將膜平鋪于保鮮膜上，正面朝下。TBS洗膜一次，5min。加入二抗（二抗用5%奶粉）室溫孵育1h，緩慢搖動。加入一抗（封閉緩沖液），室溫孵育1h，放入4℃孵育過夜。封閉液中室溫搖動封閉1h，背景較高的話可以4℃孵育過夜。紅色為正極，黑色為負極，電極不要放反。（2） 裝配轉(zhuǎn)膜三明治：海綿濾紙膜膠濾紙海綿，放好后趕出氣泡，膠放于負極面。3轉(zhuǎn)膜（通風(fēng)櫥）（1） 取出膠，根據(jù)預(yù)染Marker和目的蛋白大小將膠切除多余部分，將膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。3）電泳濃縮膠：恒流17 mA/塊膠, 20min(6080Vv)分離膠: 恒流28 mA/塊膠, 30min(100120V)。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。）vii. 加足夠的電泳液后(電泳槽有標(biāo)記)開始準備上樣。）vi. 測完蛋白含量后，計算含80μg蛋白的溶液體積即為上樣量。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。插梳子時要使梳子保持水平。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中（勿忘！）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層乙醇，并用水清洗膠孔中殘留的乙醇，吸水紙將水吸干。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。）ii. 配12％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，待膠面升到3/4高度時即可。然后垂直卡在架子上準備灌膠。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提?。篴) 將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。d) 裂解30 min后，然后在4℃下12000rpm離心5min，℃保存。然后置于冰上。（2）組織中總蛋白的提?。篴) 將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。C，3~5min。562nm測定吸光度。標(biāo)準曲線：1ug/ul2 ug/ulBSA012481010Water10986200待測蛋白樣品：9 ul water + 1ul protein 至96孔板反應(yīng)液：A:B=50：1配好后加入96孔板（100/孔），37176。）d) 超聲破碎Amp 65%Time 10sOn 2sOff 2se) 于4℃下12000rpm離心10min，取上清。c) 取沉淀，配制RAPI(細胞裂解液)+PMSF（100，蛋白酶抑制劑）+PI（50），70ul/孔（6孔板），槍吹勻。C，3min，棄上清，加預(yù)冷的PBS混勻，離心12000g, 4176。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。（有時一抗（磷酸化）孵育時用低濃度的奶粉或者不加）（2） 二抗稀釋液：%脫脂奶粉的TBST稀釋。4℃保存TBST：1*TBS： 1L20% tween20： 5ml4℃保存封閉緩沖液：TBST+脫脂奶粉（5%），4℃保存, 使用時，恢復(fù)室溫，一次性使用。用時取200ml，加600ml水和200 ml甲醇。10％過硫酸胺（AP） 溶解后，4℃保存，保存時間為 1 周。HCl（） SDS 溴酚藍(BPB) 去離子水定容至5ml,加β巰基乙醇250ul，分裝10％SDSSDS 10g 蒸餾水至100ml 50℃水浴下溶解，室溫保存。（562nm）6. 根據(jù)擬合好的標(biāo)準曲線所得公式計算蛋白總量，式中X為OD值，Y為蛋白質(zhì)濃度，單位為(ug/ml)。3. 4h后取出24孔板和48孔板，吸棄培養(yǎng)液，生理鹽水沖洗3遍，將材料轉(zhuǎn)移至新的24孔板和四十八孔板內(nèi)（材料和板孔相差不大可不換新的板），%tritonx100裂解液500ul（24孔板）和300ul（48孔板）過夜，4度。實驗步驟：1. 消毒材料分組：Ti，Ti5Cu,TC4,TC45Cu,Cu,稀土鈦（6種材料，3個平行樣）?；陔p縮脲反應(yīng)，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，產(chǎn)生一種紫藍色復(fù)合物，在562nm處有高的吸光值，該反應(yīng)產(chǎn)物的量與蛋白質(zhì)濃度成正比。材料表面性質(zhì)通過影響粘連蛋白的黏附來影響細胞。實驗背景：細胞在生物材料表面的粘附是通過生物識別過程來實現(xiàn)的。粘附在異物表面的血小板主要分為五類形狀：圓形，樹突狀，散布樹枝狀，鋪展和充分鋪展。A surfaceeroding poly(1,3trimethylene carbonate) coating for fully biodegradable magnesiumbased stent applications: Toward better biofunction, biodegradation and biopatibility，Acta Biomaterialia 9 (2013) 8678–8689說明：血小板是由紅骨髓中巨核細胞破碎后形成的一種無色、體積小、形態(tài)不規(guī)則的小體，初生時體積較大，衰老時則較小，平均壽命為35天。（材料先放入24孔板，3. PBS was used to remove nonadherent platelets（2）4. %的戊二醛進行固定（室溫60min），然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。血小板粘附實驗材料數(shù)量：每種材料2個樣品，1個時間點，每個時間點2個平行樣。 使用30%，50%，60%，70%，90%，100%的酒精逐步脫水，每次5min HCP2臨界點干燥儀干燥2小時 樣品上銅臺， SEM鏡下觀察紅細胞形態(tài)。 DOI 二、粘附在材料表面的紅細胞的SEM實驗實驗?zāi)康模簷z測血液中紅細胞在不同合金表面的粘附狀態(tài)實驗步驟： 實驗材料：抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、 取新鮮抗凝血8 mL，加PBS 10 mL稀釋（4:5） 抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金與適量稀釋血液混合后，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。5. 陽性對照組3管，每管超純水10mL6. 全部試管浸入37℃水浴槽中30min，輕輕混勻后置于37℃水浴槽中繼續(xù)保溫60min7. 取各試管內(nèi)液體3000rpm離心5min，吸取上清150uL放入96孔板，于分光光度計545nm波長處測定吸光度8. 取3次實驗的平均值計算溶血率（Hemolysis rate，HR）:HR=(樣品吸光度陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度陰性對照吸光度) 100%9. 按ISO規(guī)定溶血率≦5%，則材料符合醫(yī)用植入材料的溶血實驗要求；溶血率＞5%，則表示實驗材料有溶血作用。血液相容性一、溶血率實驗實驗?zāi)康模簷z測含銅鈦合金對血液中紅細胞的破溶血作用實驗步驟：1. 實驗材料：抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、陰性對照組（PBS），陽性對照組（超純水）2. 取新鮮抗凝血8 mL，加PBS 10 mL稀釋（4:5）3. 抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金與適量無菌PBS混合，每組各3管。在拍照的時候最好找同一個視野進行拍照，最好為中部。系時候成管所需時間較長。成環(huán)與細胞的密度有關(guān)，細胞少則無法成環(huán)，細胞太多會大片生長，也無法成環(huán)，可以做個預(yù)實驗探索下細胞的密度。將細胞以專用培養(yǎng)基+10%專用血清的培養(yǎng)液稀釋以2*104/well/100 ul的濃度加入96孔板（可根據(jù)實驗需要進行稀釋：可以先加浸提液50ul，再加入50ul細胞懸液，防止細胞被液體沖亂；也可直接先用浸提液和細胞懸液在ep管中混勻，再加入100ul于96孔板基質(zhì)膠中），前后微微反動孔板使細胞均勻鋪展，注意避免液體傾出；將孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4,8,10,12,16h后于顯微鏡下觀察成管現(xiàn)象，尋找環(huán)狀的細胞管。實驗時取出預(yù)冷的槍頭以無血清的高糖DMEM培養(yǎng)液1:3（培養(yǎng)基：膠）稀釋基質(zhì)膠，此步驟要迅速；（混勻時千萬注意不要吹起氣泡）以150200 ul/cm2生長面積的比例（蓋住底面高出23mm即可，一般取100 ul）加入稀釋好的基質(zhì)膠至96孔板中；（加膠時千萬不要吹起氣泡，氣泡是戳不掉的，直接影響成膠）。注：細胞數(shù)不用太多（約50%），細胞數(shù)過多會造成透化、抗體孵育等不充分如果細胞貼壁不牢，可以適當(dāng)延長固定時間（1030min）如果雙標(biāo)，一抗一定選擇不同源性的，并且要相應(yīng)的選擇好二抗。根據(jù)經(jīng)驗，遺傳所四樓正置顯微鏡1:500稀釋即可；所里共聚焦顯微鏡稀釋比例需為1:100。免疫熒光一、實驗準備片子處理將新片子用1%的HCl泡片子1h，再用75%，用紗布擦干凈即可備用試劑配備透化液 %TritonX100/PBS封閉液 5%BSA/PBST（%TritonX100）抗體稀釋液 2%BSA/PBST（%TritonX100）DAPI染液 一抗稀釋 1:1001:500（依據(jù)抗體說明書）二抗稀釋（避光） 1:1001:500注：DAPI先用超純水配成5mg/ml的儲存液，保存在20℃，此乃原始儲存液。 鋪板前用記號筆在孔底部畫45條平行線（方便拍照時區(qū)域定位）；此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N，BD有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP2的表達。）顯微鏡照相和細胞計數(shù)：取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)一般采用510個，隨機選取，統(tǒng)計計數(shù)。(2). 配制簡單方便。5細胞染色用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞染色：%結(jié)晶紫染色。）4 培養(yǎng)細胞常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。l。3 接種細胞 取細胞懸液100－200181。 消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認為，F(xiàn)BS仍是最合適的。使用前于4℃冰箱冰水混合物中融化過夜。上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，%% BSA。HUVECS cells 實驗protocolTranswell1．實驗用品：小室: coster的24孔板的transwell的8181。 避光、室溫反應(yīng)5 min。將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；e.在500μL的BindingBuffer中加入2μL Annexin VFITC，5 μLPI，混勻；d.用冰冷PBS洗滌細胞兩次；c.將細胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞凋亡，并設(shè)立