【正文】 陰性對照組；b.a. 在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC/PI）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI）。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。 b. 熒光補償調(diào)節(jié)：使用經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償去除光譜重疊和設定十字門的位置。 用冰冷PBS洗滌細胞后， 1000g離心5 min，棄上清，加入500uL的Binding Buffer輕輕重懸細胞。2) 因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。對PS有高度的親和性。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。一、實驗原理細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。因此，有關凋亡的研究在臨床和基礎等各個領域已經(jīng)廣泛開展，凋亡細胞的檢測方法顯得非常重要。}10. 根據(jù)酶活性定義，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。在酶標儀下測定其OD值。本試劑盒測定的是DEA酶活力單位。25℃條件下，每分鐘水解paranitrophenyl phosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個Glycine酶活力單位。如果不能立即測定，可以在數(shù)小時內(nèi)完成測定，所顯現(xiàn)的黃色在數(shù)小時內(nèi)穩(wěn)定。7. 在405nm測定吸光度。）6. 每孔加入100 uL反應終止液終止反應。同時設置空白組和標準曲線組。b. 標準品工作液：取10 uL p nitrophenol溶液 (10mM)。a. 顯色底物溶液：取一管顯色底物，充分溶解和混勻，冰上放置。樣品可以80℃凍存，但需避免反復凍融。（細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞和細胞，如果有必要需進行適當勻漿，隨后離心取上清，用于堿性磷酸酶的檢測。每個材料4個復孔。實驗周期：7,14，21天實驗材料數(shù)量：每種材料三個時間點，每個時間點4個平行樣。產(chǎn)物黃色越深，吸光度越大，說明堿性磷酸酶檢活性越高，反之則酶活性越低。6. 用正置顯微鏡拍照。3. 細胞貼壁生長至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導后期，需每天對細胞進行換液，以保證能夠提供足夠的營養(yǎng)；同時，在誘導后期，對細胞進行換液一定要小心），棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium, Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,天狼星紅染色目的：考察Titanium alloys 表面改性后對細胞成骨誘導后膠原蛋白結(jié)果的影響細胞：小鼠胚胎成骨細胞MC3T3E1直接實驗方案：1. 準備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉(zhuǎn)移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在材料上種細胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板），使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。從圖a可知，四種材料均能夠促進rBMSCs細胞的成骨分化，經(jīng)過等離子注入的材料對細胞的促成骨效果比純鈦強，且Zn/AgPIII材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的促成果效果更佳有效。7. 每孔加入氯代十六烷基吡啶（10%）（要沒過材料表面）溶解后取150ul裂解液加入96孔板內(nèi)于620nm波長處測OD值注意事項：茜素紅染色的成功關鍵步驟是固定液的選擇和茜素紅的PH，這個很重要。4. PBS洗3次，加入20 mg/ml ℃培養(yǎng)箱染色30min；(染料要沒過材料)5. 棄茜素紅，PBS洗6次至無色。每個材料4個復孔。材料數(shù)量：每種材料3個時間點（7day，14day，21day），每個時間點4個平行樣。3. 放入離心管內(nèi)加熱溶解備用；4. 最終10%的氯代十六烷基吡啶應呈微黃色。配制10%的氯代十六烷基吡啶目的：為茜素紅定量測OD值做準備步驟：1. ，配制成10mM磷酸氫二鈉溶液。 Dex溶于1223ml乙醇中，*103M。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,促成骨相關實驗配制成骨分化誘導液 將50 mg ASAP溶解于10 ml aMEM配制成濃度為5mg/ml(100X)的儲存液，℃保存,工作濃度為50mg/ml。粘貼時應注意動作輕巧，保持觀察面清潔。但是由于冷凍干燥需要低溫條件，且時間長（通常需要數(shù)小時或數(shù)十小時），樣品也較容易凍傷或產(chǎn)生冰晶。11. 干燥：采用冷凍干燥法，將脫水后的樣品投入液氮中，使樣品迅速冷凍，然后再把冷凍的樣品放入真空內(nèi)，讓樣品中已結(jié)成冰的溶劑及水分在高真空下升華，即由固體直接變成氣體，從而使樣品得以干燥。固定是利用化學試劑使細胞的細微結(jié)構(gòu)或化學成分保持生前狀態(tài)。再加入200ml細胞重懸液至材料表面，輕微震蕩。(先加入800ml培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。材料放置孔板中部。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,SEM觀察細胞的樣品制備目的：比較Magnesium alloys表面改性前后的細胞直接粘附材料表面的狀態(tài)細胞：小鼠胚胎成骨細胞MC3T3E1方案：7. 準備一個小燒杯，將材料浸沒在裝有乙醇的小燒杯中滅菌10min。同時，在4h的時候，與純鈦相比，其他三種實驗組均能夠明顯看到材料表面上的細胞明顯鋪展，且在Zn/AgPIII材料表面上細胞的微絲更明顯，說明Zn/AgPIII材料表面更適合細胞生長。熒光：1 通道：DAPI， 2通道： FITC，3通道：羅丹明觀察：1. 細胞骨架形態(tài)是否發(fā)生變化 2. 肌動微絲是否出現(xiàn)增粗 3. 細胞間連接是否增多 4. 細胞形態(tài)：多角形變成梭形，偽足明顯增多注意：DAPI和鬼筆環(huán)肽具有劇毒性，在使用的時候應盡量小心，一定要帶手套操作，避免將染料弄到皮膚上。打開顯微鏡，熒光，電腦。省染料的做法：取封口膜一塊，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使細胞直接接觸染料染色，注意過程中染料不能干。5. 在暗室中，取5ml ml(終濃度為165nM，加入鬼筆環(huán)肽（覆蓋即可，用完可以回收利用），室溫避光孵育40 min，吸出染液，用PBS清洗洗3次。）3. 細胞孵育5h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS震蕩清洗兩次（24h時間點：加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，用PBS振蕩清洗兩次），%甲醛（PBS中）在室溫下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。再加入200 ml細胞重懸液至材料表面，輕微震蕩。(先加入800ml培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。材料放置孔板中部。實驗方案：1. 準備一個小燒杯，將材料浸沒在裝有乙醇的小燒杯中滅菌1015min。羅丹明熒光物質(zhì)標記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細胞的Factin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布。它們對細胞形態(tài)的維持，細胞的生長、運動、分裂、分化、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、基因表達等都起到重要作用。細胞CCK8實驗結(jié)果參照下圖：如圖所示，相同濃度浸提液與細胞共培養(yǎng)1天和3天后，100%WE43浸提液對細胞的毒性比較大，細胞存活率分別為60%和40%左右，而釹元素等離子注入WE43 100%浸提液與細胞共培養(yǎng)1天和3天后，細胞存活率分別為90%和100%左右，且在低濃度情況下釹元素等離子注入WE43能夠促進細胞增殖，表明經(jīng)過改性后的WE43具有良好的生物相容性。本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。RGR(%)=(材料組吸光度空白組吸光度)/(對照組吸光度空白組吸光度) 100%表1 分級標準和評定結(jié)果0級1級2級3級4級5級RGR(%)≧1007599507425491240評定結(jié)果合格合格結(jié)合細胞形態(tài)綜合評價不合格不合格不合格注意事項：由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。：在空白孔中加入與實驗組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度即為空白對照。進一步稀釋成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90 ml培養(yǎng)基和10 ml FBS位對照組，每一樣品設5個復孔。取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在96孔板上種細胞，密度為5*103/孔，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細胞貼壁。提取上層液在4℃中保存，（加過雙抗可不滅菌），離心去上清液（液體有揮發(fā)就補齊），4℃保存，材料回收。將材料于75%的乙醇中滅菌10 min，再用PBS清洗3次，轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入培養(yǎng)基后在桌面來回動1020 s。在用于浸泡之前，用2000砂紙對WE43再次進行打磨，以去除表面的氧化膜。材料浸提液CCK8的實驗方案對材料先進行封膠處理，封膠時底面只弄一次，盡量平整、薄。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。備注：①一個方塊材料為1cm2，一塊材料消耗1ml培養(yǎng)基②在材料上培養(yǎng)細胞時，需每天進行換液，防止鎂合金腐蝕對細胞造成影響。（若為鎂合金的control組，則應將control組中的細胞消化下來，再與CCK8進行孵育。（其他材料：待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)1,3,7天，棄培養(yǎng)基， PBS洗2次(PBS需吸干)，清洗后，將材料轉(zhuǎn)移至別的空白孔中，每孔加入400ml10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，于酶標儀450 nm 和650 nm波長測定其吸光度。48孔板，每孔300ml。每個材料4個復孔。若有氣泡，戳破。（若材料為鈦合金，可把75%滅菌后的材料放置于超凈臺，再用紫外照射一段時間后，將材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培養(yǎng)基進行清洗。20℃干燥避光保存，有效期二年。使用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。CCK8 實驗目的：考察合金改性前后對對細胞毒性的變化 細胞：小鼠胚胎成骨細胞MC3T3E1，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞RBMS