【正文】 銅臺， SEM鏡下觀察紅細胞形態(tài)。A surfaceeroding poly(1,3trimethylene carbonate) coating for fully biodegradable magnesiumbased stent applications: Toward better biofunction, biodegradation and biopatibility，Acta Biomaterialia 9 (2013) 8678–8689說明：正常紅細胞為圓形面包圈形狀，當紅細胞形狀變成不規(guī)則時，說明材料對紅細胞有溶血作用，血液相容性不理想。血小板粘附實驗材料數(shù)量：每種材料2個樣品，1個時間點，每個時間點2個平行樣。1. PRP (富血小板血漿)was prepared by centrifuging whole blood for 10 min at 1000rpm.(血小板在上層清液)2. PRP was dripped onto the sample(300uL/孔) plates and incubated at 37℃ for 1h。（材料先放入24孔板，3. PBS was used to remove nonadherent platelets（2）4. %的戊二醛進行固定（室溫60min），然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。5. 使用30%，50%，60%，70%，90%，100%的酒精逐步脫水，每次5min6. HCP2臨界點干燥儀干燥2小時7. 樣品上銅臺，8. SEM鏡下觀察細胞形態(tài)。A surfaceeroding poly(1,3trimethylene carbonate) coating for fully biodegradable magnesiumbased stent applications: Toward better biofunction, biodegradation and biopatibility，Acta Biomaterialia 9 (2013) 8678–8689說明：血小板是由紅骨髓中巨核細胞破碎后形成的一種無色、體積小、形態(tài)不規(guī)則的小體，初生時體積較大，衰老時則較小，平均壽命為35天。血小板具有粘附于異物表面的功能，可發(fā)生粘附、變形、聚集、釋放等反應，相同實驗條件下，若材料表面上的血小板粘附數(shù)量少，聚集少，變形少（血小板不長出多余偽足），則表面其血液相容性好。粘附在異物表面的血小板主要分為五類形狀：圓形，樹突狀，散布樹枝狀，鋪展和充分鋪展。蛋白粘附實驗目的：看材料蛋白粘附情況。實驗背景：細胞在生物材料表面的粘附是通過生物識別過程來實現(xiàn)的。當生物材料與血液、組織液以及含有血清的培養(yǎng)基接觸時，材料的表面會迅速地吸附一層蛋白質(zhì)分子，然后才是細胞到達材料的表面，即細胞通過整合素與生物材料相黏附。材料表面性質(zhì)通過影響粘連蛋白的黏附來影響細胞。實驗原理：BCA(Bicinchoninic acid)法是目前應用比較廣泛的蛋白質(zhì)濃度測定方法。基于雙縮脲反應，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，產(chǎn)生一種紫藍色復合物，在562nm處有高的吸光值，該反應產(chǎn)物的量與蛋白質(zhì)濃度成正比。材料數(shù)量：每種材料,1個時間點，每個時間點2個平行樣。實驗步驟：1. 消毒材料分組：Ti，Ti5Cu,TC4,TC45Cu,Cu,稀土鈦（6種材料，3個平行樣）。2. 材料編號，將不同型號材料分別植入24孔板和48孔板，每孔加 1000uL（24孔板）和600ul（48孔板）培養(yǎng)液（aMEM）（無細胞），將各培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。3. 4h后取出24孔板和48孔板，吸棄培養(yǎng)液，生理鹽水沖洗3遍，將材料轉(zhuǎn)移至新的24孔板和四十八孔板內(nèi)（材料和板孔相差不大可不換新的板），%tritonx100裂解液500ul（24孔板）和300ul（48孔板）過夜，4度。4. 取裂解液25ul于96孔板，再加入200ul的BCA（A液：B液=50:1），37℃孵育30min后,5. 96孔板于酶標儀下檢測吸光值OD。（562nm）6. 根據(jù)擬合好的標準曲線所得公式計算蛋白總量，式中X為OD值，Y為蛋白質(zhì)濃度，單位為(ug/ml)。In?uence of ?uoride treatment on surface properties, biodegradation and cytopatibility of Mg–Nd–Zn–Zr alloy，J Mater Sci: Mater Med (2014) 25:791–799, DOI WesternBlot一、溶液配制5SDS loading buffer1mol/L TrisHCl（） SDS 溴酚藍(BPB) 去離子水定容至5ml,加β巰基乙醇250ul，分裝10％SDSSDS 10g 蒸餾水至100ml 50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％過硫酸胺（AP） 溶解后，4℃保存，保存時間為 1 周。電泳緩沖液：5running bufferTris （） g甘氨酸（） SDS(劇毒) 5g用蒸餾水溶解至1000ml轉(zhuǎn)移緩沖液：5Trans bufferTris堿 加水至總量1L。用時取200ml，加600ml水和200 ml甲醇。10*TBS：（pH：） Tris ：NaCl ：80g H2O ：補足1L（）使用時稀釋10倍。4℃保存TBST：1*TBS： 1L20% tween20： 5ml4℃保存封閉緩沖液：TBST+脫脂奶粉（5%），4℃保存, 使用時，恢復室溫，一次性使用。（1） 一抗稀釋液：按照比例用封閉緩沖液稀釋。（有時一抗（磷酸化）孵育時用低濃度的奶粉或者不加）（2） 二抗稀釋液：%脫脂奶粉的TBST稀釋。二、實驗步驟1 蛋白樣品制備（1）單層貼壁細胞總蛋白的提?。篴) 倒掉培養(yǎng)液，加℃預冷的PBS（ ～）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。b) 加入TE消化細胞，12000g, 4176。C，3min，棄上清，加預冷的PBS混勻，離心12000g, 4176。C，3min。c) 取沉淀，配制RAPI(細胞裂解液)+PMSF（100，蛋白酶抑制劑）+PI（50），70ul/孔（6孔板），槍吹勻。（亦可加PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。）d) 超聲破碎Amp 65%Time 10sOn 2sOff 2se) 于4℃下12000rpm離心10min，取上清。（提前開離心機預冷）f) BCA法測定蛋白濃度。標準曲線：1ug/ul2 ug/ulBSA012481010Water10986200待測蛋白樣品：9 ul water + 1ul protein 至96孔板反應液：A:B=50：1配好后加入96孔板（100/孔），37176。C，30min。562nm測定吸光度。g) 加5SDS loading buffer，混勻，95176。C，3~5min?；靹蚝蠓盅b。（2）組織中總蛋白的提?。篴) 將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。b) 加400μl單去污劑裂解液裂（含PMSF4,PI））于勻漿器中進行勻漿。然后置于冰上。c) 幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。d) 裂解30 min后，然后在4℃下12000rpm離心5min，℃保存。（3）加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提?。篴) 將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。b) 棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。c) 用槍洗干上清后，加100 μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解2 SDS－PAGE電泳1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。2）灌膠與上樣i. 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）ii. 配12％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，待膠面升到3/4高度時即可。然后膠上加一層乙醇封膠，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）iii. 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層乙醇，并用水清洗膠孔中殘留的乙醇，吸水紙將水吸干。iv. 按前面方法配5％的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中（勿忘！）。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。v. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）vi. 測完蛋白含量后，計算含80μg蛋白的溶液體積即為上樣量。（上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μl樣品。）vii. 加足夠的電泳液后(電泳槽有標記)開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。3）電泳濃縮膠：恒流17 mA/塊膠, 20min(6080Vv)分離膠: 恒流28 mA/塊膠, 30min(100120V)。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。3轉(zhuǎn)膜（通風櫥）（1） 取出膠，根據(jù)預染Marker和目的蛋白大小將膠切除多余部分，將膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。根據(jù)切后膠大小剪同樣大小的PVDF膜和濾紙，將膜放入甲醇中1min，然后將膜和濾紙放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。（2） 裝配轉(zhuǎn)膜三明治：海綿濾紙膜膠濾紙海綿，放好后趕出氣泡，膠放于負極面。（蛋白由負極轉(zhuǎn)向正極）（3） 放入轉(zhuǎn)移槽中轉(zhuǎn)移，100V轉(zhuǎn)移14h，冰浴低溫。紅色為正極，黑色為負極，電極不要放反。4封閉取出雜交膜，TBS 洗膜5min。封閉液中室溫搖動封閉1h，背景較高的話可以4℃孵育過夜。5一抗孵育TBST洗膜三次，每次5min。加入一抗（封閉緩沖液），室溫孵育1h，放入4℃孵育過夜。6二抗孵育TBST洗三次，每次5min。加入二抗（二抗用5%奶粉）室溫孵育1h，緩慢搖動。7曝光TBST洗膜三次，每次5min。TBS洗膜一次，5min。用紙巾擦除多余的TBS，但不使膜干燥。將膜平鋪于保鮮膜上，正面朝下。ECL 按照1:1快速混勻，加到保鮮膜上，將膜浸勻。去除多余的ECL，將保鮮膜覆蓋于膜上，避免產(chǎn)生氣泡。放于暗盒中曝光。可以4張膠片一起曝光。顯影1min左右。用水洗，然后定影。根據(jù)情況決定最佳時間。