【正文】 測流式細(xì)胞儀分析： FITC: Ex=488，Em=530nm； PI: Ex=488，Em=≥630a. Annexin VFITC 的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測，PI紅色熒光（流式Ex=488，Em≥630）通過FL2或FL3檢測，建議使用FL3。b. 熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。5) 結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC/PI）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI）。2. 熒光顯微照相操作方法：1) 滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；2) 對于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；應(yīng)同時設(shè)置陰性對照。a. 將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；b. 用冰冷PBS洗滌細(xì)胞兩次；c. 在500μL的BindingBuffer中加入2μL Annexin VFITC，5 μLPI，混勻；d. 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；e. 避光、室溫反應(yīng)5 min。3) 將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片（FITC和Rhodamine）觀察AnnexinV FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色4) 結(jié)果判斷：結(jié)合Annexin VFITC的凋亡細(xì)胞的質(zhì)膜將顯示綠色光圈；膜結(jié)構(gòu)不完整的壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞在整個核區(qū)被PI染成紅色而質(zhì)膜為AnnexinVFITC陽性呈現(xiàn)為綠色光圈。HUVECS cells 實(shí)驗(yàn)protocolTranswell1．實(shí)驗(yàn)用品：小室: coster的24孔板的transwell的8181。m。上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，%% BSA?；|(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，Matrigel是BD公司生產(chǎn)的，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，4度時是液體，在37度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。使用前于4℃冰箱冰水混合物中融化過夜。下層培養(yǎng)液：下層常用含5%－10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定，侵襲力弱的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認(rèn)為，F(xiàn)BS仍是最合適的。包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。2 制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－10105，最好不要超過5105。3 接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100－200181。l加入Transwell小室， 24孔板小室一般200181。l。 24孔板下室一般加入500181。l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。（這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。）4 培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。5細(xì)胞染色用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞染色：%結(jié)晶紫染色。（這種方法有如下優(yōu)勢：(1). 不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。(2). 配制簡單方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm 測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。）顯微鏡照相和細(xì)胞計(jì)數(shù)：取若干個視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個數(shù)一般采用510個，隨機(jī)選取，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。另：值得注意的是，有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。建議實(shí)驗(yàn)前先用酶譜法檢測MMPs的表達(dá)，特別是MMP2的表達(dá)。如果不清楚細(xì)胞MMPs的表達(dá)情況，就盲目進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，可能會造成不必要的浪費(fèi)。此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N，BD有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細(xì)胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 鋪板前用記號筆在孔底部畫45條平行線（方便拍照時區(qū)域定位）； 鋪滿六孔板細(xì)胞，貼壁；2．用10ul槍頭和直尺于垂直平行線方向進(jìn)行劃痕，45條，PBS洗一遍；3．換含不同藥物濃度的無/有血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；4. 不同時間取不同位置觀察劃痕距離并顯微鏡拍照。免疫熒光一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備片子處理將新片子用1%的HCl泡片子1h，再用75%，用紗布擦干凈即可備用試劑配備透化液 %TritonX100/PBS封閉液 5%BSA/PBST（%TritonX100）抗體稀釋液 2%BSA/PBST（%TritonX100）DAPI染液 一抗稀釋 1:1001:500（依據(jù)抗體說明書）二抗稀釋（避光） 1:1001:500注：DAPI先用超純水配成5mg/ml的儲存液，保存在20℃，此乃原始儲存液。將此原始儲存液1:50稀釋成100μg/ml的儲存液，染色時根據(jù)情況的不同1:1001:500稀釋成工作液，此工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，遺傳所四樓正置顯微鏡1:500稀釋即可；所里共聚焦顯微鏡稀釋比例需為1:100。二、實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)基不棄，加27μl/ml的甲醛室溫固定10minPBS洗3次，5min/次，洗時輕輕搖晃用透化液室溫透化10minPBS洗3次，5min/次用封閉液37℃封閉1hPBS洗3次，5min/次加入一抗室溫孵育40min，如果雙標(biāo)，這兩種一抗可以一起加PBST洗3次，5min/次加入二抗室溫孵育30min，此后的過程都需要避光PBST洗3次，5min/次1稀釋DAPI染液（儲存液濃度100μg/μl），加入DAPI染液室溫避光染色210min1PBST洗3次，5min/次1抗淬滅劑封片，必要時可用指甲油將邊緣封住，用正置顯微鏡或用共聚焦顯微鏡觀察即可。注：細(xì)胞數(shù)不用太多（約50%），細(xì)胞數(shù)過多會造成透化、抗體孵育等不充分如果細(xì)胞貼壁不牢，可以適當(dāng)延長固定時間（1030min）如果雙標(biāo)，一抗一定選擇不同源性的，并且要相應(yīng)的選擇好二抗。一般來說，F(xiàn)ITC的二抗特異性好，背景低；羅丹明的二抗背景較高DAPI染色需要摸索，染得過亮或過弱都不好小管形成實(shí)驗(yàn)4℃過夜溶解基質(zhì)膠（基質(zhì)膠只有在4℃的時候才是液態(tài)），培養(yǎng)基，槍頭盒，96孔板和滅菌EP管需提前放置冰箱預(yù)冷。實(shí)驗(yàn)時取出預(yù)冷的槍頭以無血清的高糖DMEM培養(yǎng)液1:3（培養(yǎng)基：膠）稀釋基質(zhì)膠，此步驟要迅速；（混勻時千萬注意不要吹起氣泡）以150200 ul/cm2生長面積的比例（蓋住底面高出23mm即可，一般取100 ul）加入稀釋好的基質(zhì)膠至96孔板中；（加膠時千萬不要吹起氣泡，氣泡是戳不掉的，直接影響成膠）。將96孔板放置在培養(yǎng)箱中1h讓膠凝固。將細(xì)胞以專用培養(yǎng)基+10%專用血清的培養(yǎng)液稀釋以2*104/well/100 ul的濃度加入96孔板（可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行稀釋：可以先加浸提液50ul，再加入50ul細(xì)胞懸液，防止細(xì)胞被液體沖亂；也可直接先用浸提液和細(xì)胞懸液在ep管中混勻，再加入100ul于96孔板基質(zhì)膠中），前后微微反動孔板使細(xì)胞均勻鋪展，注意避免液體傾出；將孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4,8,10,12,16h后于顯微鏡下觀察成管現(xiàn)象，尋找環(huán)狀的細(xì)胞管。觀察：小管與小管之間的連接數(shù)小管的長度及小管的管徑大小注意：每個樣品做兩個孔即可。成環(huán)與細(xì)胞的密度有關(guān)，細(xì)胞少則無法成環(huán)，細(xì)胞太多會大片生長，也無法成環(huán)，可以做個預(yù)實(shí)驗(yàn)探索下細(xì)胞的密度。血管形成實(shí)驗(yàn)需要高濃度的基質(zhì)膠，基質(zhì)膠濃度太低膠原蛋白等含量不夠很難成管。系時候成管所需時間較長。在顯微鏡下觀察，膠時三維的，所以細(xì)胞長在上面不可能完全聚焦清楚，拍照時應(yīng)選較為清晰呈現(xiàn)小管的圖片即可。在拍照的時候最好找同一個視野進(jìn)行拍照，最好為中部。因?yàn)檫吘壭?yīng)，孔邊上的細(xì)胞更易成環(huán)。血液相容性一、溶血率實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測含銅鈦合金對血液中紅細(xì)胞的破溶血作用實(shí)驗(yàn)步驟：1. 實(shí)驗(yàn)材料：抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、陰性對照組（PBS），陽性對照組（超純水）2. 取新鮮抗凝血8 mL，加PBS 10 mL稀釋（4:5）3. 抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金與適量無菌PBS混合，每組各3管。（24孔板加厚：，24孔板：，?。海瑔挝幻娣e的液體體積相同即可）4. 陰性對照組3管，每管加同批號PBS10mL。5. 陽性對照組3管，每管超純水10mL6. 全部試管浸入37℃水浴槽中30min，輕輕混勻后置于37℃水浴槽中繼續(xù)保溫60min7. 取各試管內(nèi)液體3000rpm離心5min，吸取上清150uL放入96孔板，于分光光度計(jì)545nm波長處測定吸光度8. 取3次實(shí)驗(yàn)的平均值計(jì)算溶血率（Hemolysis rate，HR）:HR=(樣品吸光度陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度陰性對照吸光度) 100%9. 按ISO規(guī)定溶血率≦5%，則材料符合醫(yī)用植入材料的溶血實(shí)驗(yàn)要求；溶血率＞5%，則表示實(shí)驗(yàn)材料有溶血作用。Sintered metallic foams for biodegradable bone replacementMaterials,J Porous Mater (2014) 21:131–140。 DOI 二、粘附在材料表面的紅細(xì)胞的SEM實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測血液中紅細(xì)胞在不同合金表面的粘附狀態(tài)實(shí)驗(yàn)步驟： 實(shí)驗(yàn)材料：抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、 取新鮮抗凝血8 mL，加PBS 10 mL稀釋（4:5） 抗菌Ti6Al4V5Cu合金、普通Ti6Al4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金與適量稀釋血液混合后，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。 棄血液，PBS洗兩次，%的戊二醛進(jìn)行固定（室溫60min），然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。 使用30%，50%，60%，70%，90%，100%的酒精逐步脫水，每次5min HCP2臨界點(diǎn)干燥儀干燥2小時 樣品上