【正文】 化后，每孔加入500ml 10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液終止消化，1200 rpm離心5min，棄上清，加入400 ml 10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450nm 波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。）4. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：種3*104/孔細(xì)胞于24孔板中，加入培養(yǎng)基分別孵育1,3,7天后，棄培養(yǎng)基，PBS洗23次(PBS需吸干)，每孔加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測(cè)定450 nm的吸光度。）5. 空白對(duì)照：在空白孔中加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測(cè)定450nm的吸光度即為空白對(duì)照。③當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。④特別重要的是，在加入CCK8之前，必須把材料轉(zhuǎn)移至其他空白孔中，以免貼壁在材料外的細(xì)胞造成的實(shí)驗(yàn)誤差。封膠完畢后，在干燥箱中存放3天，多余的膠用手術(shù)刀切掉，盡量使底部保持平整。準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯，在燒杯中滅菌，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物。材料與aMEM+雙抗培養(yǎng)基在5%CO2，37℃條件下孵育3天（1ml/cm2）。細(xì)胞用aMEM培養(yǎng)基+10%FBS+100U/ml 雙抗培養(yǎng)。6. 24h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入材料提取液90ml+10ml FBS(10%)。7. 37℃培養(yǎng)1,3,7天，棄提取液，PBS洗23次，每孔加入100 ml不含血清的10%CCK8培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。9. 按細(xì)胞增值度法計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率（Relative growth rate，RGR），并按表1的要求，將RGR值轉(zhuǎn)化成六級(jí)，評(píng)定材料毒性。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。Improvement of corrosion resistance and biopatibility of rareearth WE43 magnesium alloy by neodymium selfion implantation, Corrosion Science 94 (2015) 142–155.細(xì)胞骨架和DAPI染色（細(xì)胞粘附測(cè)試）定義：細(xì)胞骨架是由蛋白質(zhì)絲搭建起的骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),主要包括微管，微絲，中間纖維。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕容^材料表面改性前后早期細(xì)胞直接粘附的狀態(tài)細(xì)胞：小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3E1原理：利用抗原抗體反應(yīng)原理，就是以一抗作為探針，它與目的蛋白作用并連接，再用帶有熒光（或同位素）標(biāo)記的二抗與一抗作用，最后顯色，發(fā)光位置就有目的蛋白。DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈 DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化，固定過和沒有固定過的活細(xì)胞均可用DAPI染色。將材料放置24孔板中用PBS震蕩洗兩次，培養(yǎng)基洗一次。2. 細(xì)胞以5*104/孔接種，使細(xì)胞懸液均勻的鋪滿整個(gè)材料表面，孵育5 h。若有氣泡，戳破。)（若材料為鈦合金，則可將細(xì)胞懸液配成配制濃度為2104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別注入已置入材料的無菌24孔板。4. %（體積比）TritonX100（PBS中）破膜58min，棄去TritonX100上清液，PBS洗3次。6. 加入DAPI溶液室溫下染色35min，棄去染液，用PBS洗3次，加入PBS，熒光顯微鏡觀察，并拍照記錄。正置熒光顯微鏡觀察法：取干凈載玻片，將材料放在載玻片上（事先泡在PBS中，取出時(shí)用吸水紙輕輕拭干，有細(xì)胞的表面朝上放置）。先在顯微鏡以（X100）即（10倍物鏡）觀察整體情況。細(xì)胞骨架和DAPI熒光染色圖片結(jié)果如下圖：如上圖所示，在1h的時(shí)候，純鈦上的細(xì)胞基本上呈現(xiàn)球形狀態(tài)沒有鋪展，而其他三種實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞有部分鋪展在材料表面，且存在有絲分裂期的細(xì)胞。細(xì)胞在四種材料上培養(yǎng)24h后，均能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上的微絲結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞與細(xì)胞之間有明顯的鏈接，表明Zn/Ag 共注入鈦合金能夠增強(qiáng)合金對(duì)rBMSCs細(xì)胞的初始粘附和伸展?fàn)顟B(tài)，同時(shí)表明材料對(duì)細(xì)胞是沒有毒性的。將材料放置24孔板中用PBS震蕩洗兩次，培養(yǎng)基洗一次。8. 細(xì)胞以5*104/孔接種，使細(xì)胞懸液均勻的鋪滿整個(gè)材料表面，孵育5 h。若有氣泡，戳破。)9. 固定：細(xì)胞孵育5h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS震蕩清洗兩次，%的戊二醛溶液（PBS稀釋）4℃固定12h。10. 脫水：將雙蒸水洗過3次的固定的樣品依次放入30%乙醇中脫水30min，50%乙醇中脫水30min，70%乙醇中脫水30min，80%乙醇中脫水10 min，90%乙醇中脫水10 min，95%乙醇中脫水10 min，100%的乙醇中脫水10 min，100%的乙醇中脫水23次。由于升華過程不經(jīng)液態(tài)，不存在表面張力的作用，因而樣品的變形較小，干燥效果較好。12. 樣品的安放及粘貼：掃描樣品在干燥之后、金屬鍍膜之前，應(yīng)用特制的導(dǎo)電膠或其他代用品將樣品粘貼在金屬樣品臺(tái)上。13. 鍍膜：將干燥的標(biāo)本用導(dǎo)電膠粘在標(biāo)本臺(tái)上（觀察面向上），對(duì)樣品進(jìn)行金屬鍍膜，使樣品表面形成連續(xù)均勻的金屬膜（20nm左右），使樣品具有良好的導(dǎo)電性，有利于進(jìn)行樣品觀察。 將630mg bglycerophosphate 溶解于 20 ml aMEM配成濃度為100mM (10X)的儲(chǔ)存液，℃保存,工作濃度為10 mM。*，濃度為1*105M(100X),分裝，20℃保存，工作濃度為100nM。2. 稱取5g氯代十六烷基吡啶加入50mL磷酸氫二鈉溶液（10mM）中溶解。茜素紅染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私飧鞣N合金促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的情況實(shí)驗(yàn)原理：茜素紅和鈣離子以鰲和方式形成復(fù)合物，通過茜紅素染色，可產(chǎn)生桔紅色沉積（鈣結(jié)節(jié)）用以識(shí)別組織細(xì)胞的鈣鹽成分，鈣鹽變化是骨細(xì)胞增殖分化和骨組織成骨潛能的標(biāo)志之一，鈣結(jié)節(jié)是成骨分化晚期的標(biāo)志。步驟：1. 準(zhǔn)備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉(zhuǎn)移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時(shí)間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，在材料上種細(xì)胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板）[細(xì)胞密度根據(jù)孔板和材料可進(jìn)行調(diào)整]，使細(xì)胞懸液均勻的鋪滿整個(gè)材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。3. 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導(dǎo)液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導(dǎo)液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)后期，需每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，以保證能夠提供足夠的營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)，在誘導(dǎo)后期，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液一定要小心），棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。6. 正置顯微鏡拍照。如上圖所示，藍(lán)色箭頭指示的為鈣結(jié)節(jié)。從圖b的吸光度可以看出結(jié)果和圖a是一致的。每個(gè)材料4個(gè)復(fù)孔。4. PBS洗3次，%天狼星紅置于37℃培養(yǎng)箱染色30min；(染料要沒過材料)5. 棄天狼星紅，PBS洗6次至無色。7. M NaOH/methanol (1:1) 溶解后取150ul裂解液加入96孔板內(nèi)于540nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值Nonviral oligonucleotide antimiR138 delivery to mesenchymal stem cell sheets and the effect on osteogenesis, Biomaterials 35 (2014) 7734 7749.堿性磷酸酶ALP 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模篈LP是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶，檢測(cè)材料是否存在促成骨作用實(shí)驗(yàn)原理：Paranitrophenyl phosphate (pNPP)是一種常用的磷酸酶顯色底物，在堿性條件下，可在堿性磷酸酶作用下生成paranitrophenol，呈黃色產(chǎn)物，可在405nm檢測(cè)吸光度。據(jù)此通過比色分析就可以計(jì)算出堿性磷酸酶活性水平，進(jìn)而反應(yīng)出材料是否有促成骨作用。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 準(zhǔn)備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉(zhuǎn)移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時(shí)間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，在材料上種細(xì)胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板），使細(xì)胞懸液均勻的鋪滿整個(gè)材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。3. 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導(dǎo)液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導(dǎo)液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)后期，需每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，以保證能夠提供足夠的營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)，在誘導(dǎo)后期，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液一定要小心），至既定時(shí)間點(diǎn)()后，取出相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，PBS/生理鹽水清洗兩遍（要輕柔，最好用巴氏吸管），500ul（24孔板）或者300ul（48孔板）%tritonx100裂解過夜4度。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑。）4. 試劑準(zhǔn)備：將所有試劑取出，恢復(fù)至室溫使用。新鮮配制的顯色底物溶液需在6小時(shí)內(nèi)使用。5. 取各種裂解后溶液50 uL順序加入到96孔板內(nèi)，而后在每孔中再加入50uL pNpp工作液，37℃，孵育30min。（空白組為50 uL顯色底物+ 50uL檢測(cè)緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)曲線組分別為1232和40微升pNpp +9987660微升顯色底物。此時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品或有堿性磷酸酶活性的孔會(huì)呈現(xiàn)不同深淺的黃色。如果不能測(cè)定405nm，也可以在400415nm范圍內(nèi)檢測(cè)吸光度。8. 堿性磷酸酶活性單位的定義： 的diethanolamine(DEA) 緩沖液中，37 ℃條件下，每分鐘水解paranitrophenyl phosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力單位，也被稱作一個(gè)DEA酶活力單位。一個(gè)Glycine酶活力單位約相當(dāng)于3個(gè)DEA酶活力單位。9. 取25ul各種裂解液加入96孔板內(nèi)，每孔加入100ul的BCA(A:B=50:1)（測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總蛋白）,37℃，孵育30min。（562nm）{需做BSA蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便計(jì)算總蛋白。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（apoptosis）與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡檢測(cè)可以：（1）用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本研究；（2）應(yīng)用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；（3）對(duì)相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評(píng)價(jià)具有舉足輕重的地位。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂