分子生物學(xué)問答題(參考版)
2025-04-10 03:17本頁面
【正文】 5）基因免疫治療。(3)基因干預(yù)。答：(1)基因置換。答：通過基因置換和基因添加，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；抑制癌基因的活性，通過于擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞的溶解和排斥反應(yīng)；通過導(dǎo)入“自殺基因殺傷癌細(xì)胞。基因調(diào)控策略大致有以下幾種：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制、基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等。73. 治療基因的受控表達(dá)策略有哪些?答：治療基因的受控表達(dá)包括控制治療基因表達(dá)的時間、空間和水平三個方面。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。證據(jù)表明一個稱為Dicer的酶，是l~aseⅢ家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，將其切割將DNA降解為19～21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。答 RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段。in vivo(活體內(nèi))是指將目的基因直接應(yīng)用于患者體內(nèi)。71. 簡述eX vivo和in vivo兩種基因治療途徑。答：將“自殺基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。突變?nèi)舭l(fā)生在生殖細(xì)胞，可引起各種遺傳性疾病；若發(fā)生在他細(xì)胞，可導(dǎo)致腫瘤、心血管疾病等69. 熒光原位雜交的特點(diǎn)及應(yīng)用包括哪些?答：(1)其探針比放射性探針更穩(wěn)定，不需要特殊的安全防護(hù)和污物處理措施；．(2)與原位雜交一樣，不需要提取和純化核酸；(3)多色TLSII可以在同一核中顯示不同的顏色，從而同時檢測兩種或多種序列；(4)應(yīng)用不同的探針可以顯示某一物種的全部基因或某一染色體、染色體片段及單拷貝序列。68. 試述內(nèi)源基因結(jié)構(gòu)突變的主要類型以及內(nèi)源基因結(jié)構(gòu)突變所致的疾病。67. 簡述基因診斷在傳染病檢測中的應(yīng)用。66. 簡述DNA指紋分析的基本流程。答：在非變性條件下，DNA分子為維持其穩(wěn)定而自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，這種構(gòu)象是由單鏈DNA分子中的堿基順序所決定，DNA分子中的堿基變異(即使只有一個堿基)可導(dǎo)致其空間構(gòu)型的改變，形成不同的構(gòu)象，導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生改變。具有高特異性、高靈敏性、早期診斷性、應(yīng)用的廣泛性等特點(diǎn)。4)移碼突變 是指DNA序列中發(fā)生單堿基，多個堿基或DNA片段的缺失或插入，導(dǎo)致突變點(diǎn)后三聯(lián)密碼閱讀框改變。2)無義突變 是由于堿基取代、缺失或插入后使得編碼某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯過程被提前終止。 基因突變的遺傳學(xué)效應(yīng)包括錯義突變、無義突變、同義突變和移碼突變。主要類型分為：1)點(diǎn)突變，在DNA序列某個位點(diǎn)上，一種堿基(核苷酸)被另一種取代所產(chǎn)生的改變 2)缺失，一個堿基或一段堿基序列丟失的改變。制備載體時，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身環(huán)化，提高重組效率。答；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能將脫氧核苷酸加到DNA的3，OH~，主要用于探針標(biāo)記；或者在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行克隆57. 將DNA分子進(jìn)行體外連接的方法：黏性末端連接、平端連接、同聚物加尾連接、人工接頭連接58. 表達(dá)融合蛋白有何優(yōu)點(diǎn) 答：表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)如下：(1)融合蛋白較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌蛋白酶水解；(2)如果融合蛋白中有信號肽序列，可產(chǎn)生分泌型產(chǎn)物．(3)可利用針對原核部分的單抗進(jìn)行親和層析，便于純化．59. 堿性磷酸酶在基因克隆中的作用。(4)DNA序列分析。(2)通過補(bǔ)齊3’端，標(biāo)記3’末端。答：利用Klenow片段(DNA聚合酶I大片段)延伸與單鏈環(huán)狀DNA模板相配對的寡核苷酸引物，這個寡核苷酸引物除了有一處與模板的堿基錯配外，其余部分均與模板互補(bǔ)，由寡核苷酸的錯配處誘發(fā)突變，并在體外新合成一個雜合雙鏈DNA，用T4 DNA連接酶將新合成的雜合雙鏈DNA連接成雙鏈閉環(huán)DNA分子，將體外合成的雜合閉環(huán)雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到E．coli細(xì)胞，由于環(huán)狀DNA復(fù)制的特點(diǎn)，就會同時產(chǎn)生野生型與誘變型兩種DNA分子，最后通過篩選，將誘變型DNA分子篩選出來。3）非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物競爭4）產(chǎn)物的再結(jié)合53. 簡述基因克隆的主要過程。52. 影響PCR擴(kuò)增平臺期的因素? (1)引物及dNTP底物濃度降低，摻入速度減慢。50. 如何提高PCR DNA聚合酶的保真性? 答：．(1)使用Taq DNA聚合酶時，摻人少量具有3’→5’外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，錯配率可降為原來的1／10；(2)使四種dNTP底物濃度相等；(3)MgCl2濃度盡可能低；(4)減少循環(huán)數(shù)。(4)探針不同：Southern印跡雜交、Northern印跡雜交的探針是單鏈的DNA或RNA，而Western免疫印跡用的探針是特異性抗體蛋白質(zhì)，而非核酸。(3)是否變性電泳不同：Southern印跡雜交是跑非變性瓊脂糖凝膠電泳，電泳之后在凝膠上用NaOH處理使DNA變性，然后轉(zhuǎn)印；Northern印跡雜交實在電泳上樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’(2)所用凝膠不同：Southern印跡雜交和Northern印跡雜交用的是瓊脂糖凝膠，而Western免疫印跡用的是SDS39。它首先用合適的限制性內(nèi)切核酸酶將DNA切割，進(jìn)行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生毛細(xì)作用，使液體經(jīng)過凝膠，從而使DNA片段由液流攜帶從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物表面，在通過和探針雜交來檢測固體支持物表面的DNA。答：Southern印跡雜交是1975年Southern建立起來的一種雜交方法，屬固相一液相雜交。它是將生長在或影印在微孔濾膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位進(jìn)行DNA變性并原位固定在濾膜上，然后用放射性標(biāo)記的探針同固定了的DNA進(jìn)行雜交經(jīng)放射自顯影后，確定哪一個菌落含有重組的DNA分子，再從參比平板上選取重組體。因為DNA、RNA或蛋白質(zhì)從凝膠向濾膜轉(zhuǎn)移的過程稱為印跡，故此將這種雜交稱為印跡雜交。將待標(biāo)記的DNA片段同隨機(jī)引物一起進(jìn)行雜交，并以雜交體上的寡聚核苷酸為引物，在ICdenow酶的作用下合成互補(bǔ)DNA鏈，當(dāng)反應(yīng)底物中有放射性的dNTP時，新合成的DNA就帶上了標(biāo)記。它Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western免疫印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))。42. 切口平移(nick translation)標(biāo)記探針的主要步驟有哪些?答：(1)DNase I造成切口；(2)DNA聚合酶Ⅲ的5’3’外切核酸酶進(jìn)行切割；(3)DNA聚合酶Ⅲ的5’3’合成酶進(jìn)行修補(bǔ)；(4)在修補(bǔ)過程
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