【正文】 中，隨著切口(nick)的移動(dòng)，將放射性的底物摻人到雙鏈DNA中。41. PCR的基本原理是什么?用PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息? 答：PCR是根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。這三個(gè)過程組成一個(gè)循環(huán)周期；每個(gè)周期合成的產(chǎn)物又可作為下—個(gè)周期的模板，如此循環(huán)往復(fù)，經(jīng)過11輪循環(huán)后，靶DNA的拷貝數(shù)理論n2=上呈2增長(zhǎng)。40. 何謂PCR?試述PCR技術(shù)的基本原理和影響茵素。答：Sanger DNA測(cè)序法是建立在兩個(gè)基本原理之上：(1)核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合；(2)可延伸的引物必須能提供游離的3’羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3’羥基末端，因此會(huì)終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行a如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲得4組長(zhǎng)度不同的DNA片段。這種修復(fù)帶給細(xì)胞很高的突變率。Ecoli的recA蛋白有雙重功能，一是在DNA重組過程中具有DNA鏈交換活性；二是具有蛋白水解酶激活活性。轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白Lex．A抑制若干編碼參與SOS應(yīng)答蛋白質(zhì)的基因表達(dá)，具有潛在的蛋白水解酶活性，E coli的DNA損傷產(chǎn)生的單鏈DNA誘導(dǎo)recA蛋白水平提高近50倍，而recA．蛋白能激活LexA自我蛋白酶解，導(dǎo)致至少15個(gè)參與SOS應(yīng)答的損傷修復(fù)蛋白基因解除阻遏狀態(tài)而表達(dá)。答：在DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，SOS應(yīng)答能夠誘導(dǎo)合成很多參與DNA損傷修復(fù)的酶和蛋白質(zhì)。DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞中存在姐妹染色體時(shí)，則通過同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，如細(xì)胞中不存在姐妹染色體時(shí)，則通過非同源末端連接的方式進(jìn)行修復(fù)。37. 人DNA雙鏈斷裂后的修復(fù)機(jī)制。E．coli的RuvA蛋白識(shí)別Holliday結(jié)構(gòu)連接處，而RuvB蛋白具有解旋酶和ATPase活性，能驅(qū)動(dòng)分支移動(dòng)。DNA單鏈區(qū)產(chǎn)生于recB、recC、recD酶的作用或DNA缺口。E．coli的recA蛋白在DNA重組中起關(guān)鍵作用。當(dāng)recB、reeC、recD遇到chi序列。recB、recC、recD酶復(fù)合物兼有解旋酶和核酸酶活性，它利用ATP水解提供能量沿著DNA移動(dòng)。36. 簡(jiǎn)述大腸埃希菌重組修復(fù)機(jī)制。答：人全基因組與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)的基本過程相同，即都有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤，解鏈并募集內(nèi)切核酸酶，切割損傷部位，解旋去除損傷位點(diǎn)，DNA聚合酶和連接酶填補(bǔ)缺口。在這一過程中，NER蛋白被募集于暫停的RNA聚合酶。這一片段被釋放后，產(chǎn)生的缺口由DNA聚合酶和連接酶填補(bǔ)。34. 簡(jiǎn)述人類核苷酸切除修復(fù)機(jī)制。兩個(gè)UvrA分子和一個(gè)UvrB分子組成復(fù)合物結(jié)合于DNA，并消耗ATP沿著DNA鏈移動(dòng)，UvrA能夠發(fā)現(xiàn)損傷造成的DNA雙螺旋變形，由UvrB負(fù)責(zé)解鏈，在損傷部位形成單鏈區(qū)，并使之彎曲約130度，接著UvrB募集內(nèi)切核酸酶UvrC，在損傷部位的兩側(cè)切斷DNA鏈，其中一個(gè)切點(diǎn)位于損傷部位5’側(cè)八個(gè)核苷酸處，而另一個(gè)切點(diǎn)位于3’側(cè)四或五個(gè)核苷酸處。33. 簡(jiǎn)述E．coli核苷酸切除修復(fù)機(jī)制。特異識(shí)別的異常堿基包括：胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶、氧化的鳥嘌呤、脫氨基的腺嘌呤、開環(huán)堿基以及碳原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。隨后，MutS錯(cuò)配DNA復(fù)合物募集該修復(fù)系統(tǒng)的第二種蛋白因子MutL,MutL再激活內(nèi)切核酸酶MutH在錯(cuò)配位點(diǎn)附近切斷錯(cuò)配核苷酸所在的一條DNA鏈，在解旋酶UvrD和外切核酸酶作用下，將包括錯(cuò)配核苷酸在內(nèi)的一條單鏈DNA去除，所產(chǎn)生的單鏈DNA缺口由DNA聚合酶Ⅲ填補(bǔ)．DNA連接酶封口，完成錯(cuò)配修復(fù)。目前，已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了四個(gè)較為完善的DNA修復(fù)通路，分別是核苷酸切除修復(fù)(nucleotide．excision repair，NER)、堿基切除修復(fù)(base—excision repair，BER)、 重組修復(fù)(rebination repair)和錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair)31. 答：，錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutS二聚體沿著DNA運(yùn)動(dòng)，能夠發(fā)現(xiàn)DNA骨架因非互補(bǔ)堿基對(duì)之間的不對(duì)稱而產(chǎn)生的變形，從而識(shí)別錯(cuò)配核苷酸。30. 簡(jiǎn)述哺乳動(dòng)物中DNA損傷的修復(fù)類型。射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而致DSIA鏈斷裂。(2)脫氧核糖變化：脫氧核糖上的每個(gè)碳原 子和羥基上的氫都能與OH反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，最后引起DNA鏈斷裂。29. 簡(jiǎn)述電離輻射可導(dǎo)致的DNA分子變化。當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長(zhǎng)(～260nm)的紫外線照射時(shí)，同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體，相鄰的兩個(gè)T、或兩個(gè)C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體。28. 簡(jiǎn)述物理因素引起的DNA損傷。27. 簡(jiǎn)述DNA分子的自發(fā)性損傷。DNA復(fù)制產(chǎn)生的誤差；(2)物理因素引起的DNA損傷：①紫外線照射引起的DNA損傷；②電離輻射引起的DNA損傷。 答：由于在沒有乳糖的條件下，lac阻遏蛋白能與操縱基因特異地結(jié)合，抑制了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。換言之：真核基因表達(dá)以正性調(diào)控為主導(dǎo)。真核基因調(diào)控中雖然也發(fā)現(xiàn)有負(fù)性調(diào)控元件，但其存在并不普遍；真核基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白作用為主。24. 請(qǐng)解釋正性調(diào)節(jié)在真核基因表達(dá)調(diào)控中的普遍意義。答：阻遏蛋白通常是與基因操縱區(qū)結(jié)合，減弱或阻止其調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，其介導(dǎo)的調(diào)控方式為負(fù)調(diào)控。22. 簡(jiǎn)述真核和原核基因表達(dá)調(diào)控共同的要素。答：(1)反式作用因子指能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各順式作用元件812 bp核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)，有時(shí)也稱轉(zhuǎn)錄因子。(3)小分子RNA對(duì)翻譯的調(diào)控作用：如lin4 RNA由lin4基因編碼，可阻抑lin14蛋白質(zhì)(一種核蛋白)，從而調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間選擇。(2)mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)：mRNA的穩(wěn)定性是翻譯水平調(diào)控的重要因素，是由于mRNA是翻譯蛋白質(zhì)的模板，其量的多少直接影響蛋白質(zhì)合成的量。當(dāng)5’端非編碼區(qū)的長(zhǎng)度在17—80核苷酸之間時(shí)，體外翻譯效率與其長(zhǎng)度成正比。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)AUG密碼子離5’端帽子的位置太近時(shí)，不容易被40S亞基識(shí)別。因此，若從5’AUG開始翻譯，就會(huì)翻譯出無活性的短肽。AUG的閱讀框通常與正常編碼區(qū)的閱讀框不一致，不是正常的開放閱讀框a如果從539。AUG。90％以上的真核mRNA符合第一AUG規(guī)律。由于存在一些特定的翻譯抑制蛋白可以與一些mRNA的5’端結(jié)合，從而抑制了蛋白質(zhì)翻譯。培養(yǎng)的真核細(xì)胞處于營養(yǎng)不足(“饑餓”)時(shí)，elF2失活，最終導(dǎo)致肽鏈合成起始效率降低。答：(1)翻譯起始的調(diào)控：①翻譯起始因子的功能調(diào)控：eIF2是蛋白質(zhì)合成過程中重要的起始因子。它的表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受基他機(jī)制調(diào)節(jié)