【正文】 ? 陰性結(jié)果判定條件 ? 最高劑量應(yīng)包括受試物許可最大劑量或最大耐受量 ， 常選 LD50或 LD80為最大劑量； ? 各劑量組的組間差距不應(yīng)過大 ， 以防漏檢僅在非常狹窄范圍內(nèi)才有突變能力的某些化學(xué)物 。重復(fù)試驗指在不同時間完成的試驗，而并非試驗中的平行樣本。 4. 試驗結(jié)果在毒理學(xué)安全性評價中的作用 ? 在評定結(jié)果之前，應(yīng)首先檢查實驗的質(zhì)量控制情況。 ? 人類致癌物檢測方法有三大類：短期試驗，哺乳動物誘癌試驗和人類流行病學(xué)觀察。 7. 觀察方法的新進(jìn)展 ? 轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測系統(tǒng) ? 微核自動化檢測技術(shù) ? 熒光原位雜交技術(shù) 三、致突變試驗中的一些注意問題 ? 1. 陰性和陽性對照的設(shè)立 ? 2. 體外試驗的活化系統(tǒng) 3. 致突變試驗與致癌試驗的關(guān)系 ? 化學(xué)物按遺傳毒性和致癌性分類：遺傳毒性致癌物，非遺傳毒性致癌物，遺傳毒性非致癌物和非遺傳毒性非致癌物四類。 ? 優(yōu)點： 此方法檢測低水平 DNA損傷的敏感性高，對樣品的細(xì)胞數(shù)要求少，適應(yīng)性高，操作簡便，省時省力。 通過檢測拖尾率 ， DNA遷移距離等數(shù)據(jù) ， 可以觀察到 DNA損傷的程度 。 ? 原理： 將單細(xì)胞懸液均勻混合在低熔點瓊脂糖中 ， 裂解液使細(xì)胞膜和核膜破裂 ， 胞漿中的蛋白質(zhì)等釋放到裂解液中 ， 只有 DNA依然留在原位 ， 強(qiáng)堿作用使 DNA雙鏈打開 ， 并將其置于電場中泳動 。 程序外 DNA合成試驗原理 ? 程序外 DNA合成試驗是觀察分離或培養(yǎng)的細(xì)胞 ， 加入標(biāo)記 DNA合成原料 ， 如 3H胸苷 ， 在 S期外是否有 DNA合成發(fā)生 ， 即是以 3H胸苷摻入細(xì)胞量的增加 ， 判斷受試物是否造成 DNA損傷 。 ? 當(dāng) DNA損傷時 ， 會發(fā)生在 S期半保留 DNA程序合成之外的DNA合成 ， 稱之為 程序外 DNA合成 (unscheduled DNA synthesis, UDS)。如果兩條染色單體間發(fā)生等位交換，可根據(jù)每條染色單體內(nèi)出現(xiàn)深淺不同的染色片段，在光鏡下進(jìn)行識別，清晰分辨出交換的染色單體，計數(shù) SCE數(shù)，判斷受試物對 DNA是否有損傷作用。 ? 將 5BrdU加入合成 DNA的原料中，經(jīng)過兩個分裂周期后，兩條染色單體的其中一條雙股 DNA鏈內(nèi)胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一條只有一股被取代。如單體內(nèi) DNA鏈?zhǔn)軗p，則可能通過這種交換方式進(jìn)行重組修復(fù)。 ? 姐妹染色單體交換 (sisterchromatid exchange， SCE)： 二條姐妹染色單體之間的物質(zhì)交換就稱為姐妹染色單體交換。 ? 讀片時每張標(biāo)本片至少要分析 100個中期分裂細(xì)胞。 ? 小鼠和大鼠的染色體核型都為近端著絲點型。 ? 非整倍體變異：染色體組中的個別染色體增加或減少。 ? 閱片計數(shù)。同樣方法再固定一次，棄上清液，留約 。 ? 低滲：打散沉淀物，加入預(yù)溫 37℃ 的 mol/L KCl約 6ml，混勻，于 37℃ 低滲 15~20min，再加固定液 l~2 ml混勻，立即以1000r/min離心 10min，棄上清液。 ? 收獲細(xì)胞：處死動物前 2~4h，秋水仙堿 4mg/kg腹腔注射。 ? 細(xì)胞通過低滲處理，使染色體均勻散開，然后固定、染色，油鏡下觀察計數(shù)?？捎^察到裂隙、斷裂、斷片、染色體環(huán)、雙或多著絲粒染色體和染色體粉碎。 3. 染色體畸變分析 ? 染色體畸變分析 (chromosome aberration analysis)： 觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變，又稱 細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(cytogeic assay)。一個細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個或多個微核。 ? PCE呈灰藍(lán)色，成熟 RBC呈粉紅色， NC呈藍(lán)紫色。 ? 將固定晾干后的骨髓片，用 Giemsa應(yīng)用液染色 10~15min，輕微沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。 ? 以 1000r/min速度離心 10 min，棄上清液，留下約 勻后，滴片兩張，推片。 ? ① 體外微核試驗 ? ② 周圍血微核試驗 ? ③ 雙核細(xì)胞法 ? ④ 免疫熒光染色法和熒光原位雜交法 改進(jìn)的微核試驗 MN NCE 試驗步驟 ? 健康成年 ICR小鼠，實驗前 24小時予環(huán)磷酰胺 40mg/kg腹腔注射染毒。 ? 常用嚙齒類動物 骨髓嗜多染紅細(xì)胞 （ PCE） 做微核試驗 。 ? 微核試驗 (micronucleus test， MNT)： 是用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)物的快速檢測方法 。 2. 微核試驗 (micronucleus test, MNT) ? 微核 (micronucleus)： 指染色體或染色單體無著絲點斷片，或因紡錘絲受損傷而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在子細(xì)胞的胞質(zhì)中，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，故稱微核。 ? 不加 S9混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物是直接致突變物。 結(jié)果判斷 ? 只要一種試驗菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是致突變物。 ? 這四個試驗菌株除了含有 his突變 ， 還有一些附加突變 ，檢測時提高試驗敏感性 。 對于間接致突變物 ， 可經(jīng)代謝活化系統(tǒng)處理成為直接致突變物 。 鼠傷寒沙門菌突變試驗原理 ? 鼠傷寒沙門氏菌的野生型菌株能自行合成組氨酸 （ his+） ，而人工誘變的突變株在組氨酸操縱子中有一個突變 ， 這種組氨酸缺陷型突變菌株必需依賴外源性組氨酸才能生長 ， 而在無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活 （ his） 。其遺傳學(xué)終點是基因突變。 如原核細(xì)胞、低等和高等真核細(xì)胞，這樣更加具有說服力。 一般體內(nèi)試驗和體外試驗各有其優(yōu)缺點，應(yīng)取長補短，綜合考慮。 如細(xì)菌回復(fù)突變試驗、微核試驗、染色體畸變分析和姐妹染色單體交換試驗，這一組試驗包括主要類型遺傳學(xué)終點。 ? 其中③指基因突變，④指染色體結(jié)構(gòu)畸變， ⑤ 指染色體數(shù)目改變。將試驗觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱為 遺傳學(xué)終點 (geic mdpoint)。 觀察項目的選擇 ? 基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映化學(xué)物的致突變性，是評價化學(xué)物致突變性唯一可靠方法。 這些因素是產(chǎn)生突變的條件 。 如代謝酶和修復(fù)酶的遺傳多態(tài)性 。 當(dāng)一個基因座位的最常見的等位基因頻率不超過 ， 這個基因座位即是多態(tài)性 。 ? 任何 DNA損傷 ， 只要修復(fù)無誤 ， 突變就不會發(fā)生； ? 如果修復(fù)錯誤或者未經(jīng)修復(fù) ， 損傷就固定下來 ， 于是發(fā)生突變 。 DNA損傷 修復(fù) 突變模式 ? 致突變作用是一個涉及多元因素相互作用的復(fù)雜細(xì)胞過程 ，它包括突變 、 修復(fù)和代謝 。 ? 易誤交聯(lián)修復(fù)： 其作用是次要的，指突變作為修復(fù)的結(jié)果或者作為損傷旁路發(fā)生的 DNA修復(fù)，包括整個核苷酸切除修復(fù)和易誤 DNA聚合酶。 嚴(yán)格來說 ， 雙鏈斷裂修復(fù)不是修復(fù) ， 而是一種耐受過程 ， 一種以容忍損傷繼續(xù)存在和在高突變率情況下 ， 換取細(xì)胞繼續(xù)生存的耐受過程 。 三、雙鏈斷裂修復(fù) ? 雙鏈斷裂修復(fù)依賴 DNA蛋白激酶 ， 通過填補損傷部位 ， 使復(fù)制得以繼續(xù)進(jìn)行 ， 但 DNA損傷部位仍然存在 。 錯配修復(fù) ? 錯配修復(fù)分識別、切除、修補等過程，是一類性質(zhì)截然不同的切除修復(fù)。 堿基切除修復(fù) ? DNA糖基化酶 識別異常的堿基，切斷堿基與脫氧核糖之間的鍵，使受損傷的堿基脫落，形成一個無嘌呤或無嘧啶的位點（ AP位點）； ? AP內(nèi)切酶 將 DNA鏈切斷； ? 插入酶 將正確堿基插入 AP位點； ? DNA聚合酶 合成 DNA片段，填補空缺； ? DNA連接酶 將新合成的互補片接上。 MGMT廣泛存在于酵母、大鼠及人類。 DNA修復(fù) 直接修復(fù) 切除修復(fù) 適應(yīng)