【正文】 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 73 ?四、轉(zhuǎn)基因小鼠在致癌作用的研究： ? 3．轉(zhuǎn)穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物小鼠 ：轉(zhuǎn)入帶有報(bào)告基因的穿梭載體，是研究體內(nèi)基因突變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。而且缺 P53小鼠加速形成惡性腫瘤，提示此基因主要在進(jìn)展階段起作用。這種小鼠對(duì)遺傳毒性致癌物敏感性并不增加。由于 P53/小鼠的腫瘤發(fā)生具有組織特異性，進(jìn)一步研究這些腫瘤的遺傳學(xué)基礎(chǔ)有助于鑒定 P53基因的功能。 72 ? 四、轉(zhuǎn)基因小鼠在致癌作用的研究： ? 2．腫瘤抑制基因敲除小鼠。這些攜帶有癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可用來(lái)研究外源化學(xué)物與腫瘤相關(guān)基因的作用及外源化學(xué)物在致癌不同階段中的作用機(jī)制。 與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子連接的癌基因轉(zhuǎn)入后可直接在某些特定的組織中高效表達(dá)，使該組織細(xì)胞處于引發(fā)狀態(tài)，這類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是研究化學(xué)物致癌作用的敏感體系。另一方面，如果僅觀察到良性腫瘤，并無(wú)惡性化進(jìn)展的證據(jù)，則將此受試物認(rèn)為是致癌物是不適宜的，此僅提示在該試驗(yàn)條件下需要進(jìn)一步研究。 ? 如在動(dòng)物組織中觀察到良性和惡性腫瘤，并有良性腫瘤向惡性化進(jìn)展的證據(jù)，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前將良性和惡性腫瘤合并是適宜的，但仍希望分別對(duì)良性和惡性腫瘤分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩個(gè)物種兩種性別動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，方能認(rèn)為未觀察到致癌作用。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 68 ? 致癌試驗(yàn)陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn) [WHO(1969)]： ? (1)對(duì)于對(duì)照組也出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率增加； ? (2)試驗(yàn)組發(fā)生對(duì)照組沒(méi)有的腫瘤類型； ? (3)試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生早于對(duì)照組； ? (4)與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組每個(gè)動(dòng)物的平均腫瘤數(shù)增加。腫瘤潛伏期即從攝入受試物起到發(fā)現(xiàn)腫瘤的時(shí)間，因?yàn)閮?nèi)臟腫瘤不易覺(jué)察，通常將腫瘤引起該動(dòng)物死亡的時(shí)間定為發(fā)生腫瘤的時(shí)間。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 67 ? （五）觀察和結(jié)果分析 ? 3．結(jié)果分析 統(tǒng)計(jì)各種腫瘤的數(shù)量 (包括良性和惡性腫瘤 )及任何少見的腫瘤、患腫瘤的動(dòng)物數(shù)、每只動(dòng)物的腫瘤數(shù)及腫瘤潛伏期。組織切片檢查應(yīng)包括已出現(xiàn)腫瘤或可疑腫瘤的器官和肉眼檢查有明顯病變的器官，應(yīng)注意觀察癌前病變。老年動(dòng)物多病易死，應(yīng)加強(qiáng)巡視，防止動(dòng)物死亡后未及時(shí)刻驗(yàn)，發(fā)生尸體組織自溶。經(jīng)飼料或飲水給以受試物時(shí)，應(yīng)記錄食物消耗量或飲水量，以計(jì)算受試物的攝入量。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 66 ? （五）觀察和結(jié)果分析 ? 1．一般觀察 每天觀察受試動(dòng)物一次，主要觀察其外表、活動(dòng)、攝食情況等。 ? 一個(gè)合格的陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)： ? ①因自溶、同類自食，或因管理問(wèn)題所造成的動(dòng)物損失在任何一組都不能高于 10％。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 65 ? （四）試驗(yàn)期限 ? ICH(1997)建議參考下面幾條準(zhǔn)則： ? (1)一般情況下，試驗(yàn)期限小鼠和倉(cāng)鼠應(yīng)為 18個(gè)月，大鼠為 24個(gè)月；然而對(duì)于某些生命期較長(zhǎng)或自發(fā)腫瘤率低的動(dòng)物品系，小鼠和倉(cāng)鼠可持續(xù) 24個(gè)月，大鼠可持續(xù) 30個(gè)月。染毒柜內(nèi)受試物濃度應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測(cè)，其分布應(yīng)均勻、恒定。每天涂抹一次，每周 3～ 7次。 ? 經(jīng)皮染毒，涂敷受試物的面積一般不少于動(dòng)物體表總面積的 10％。若摻入后的適口性不良，可用灌胃法。 ? 動(dòng)物數(shù)量： 每組至少有雌雄各 50只動(dòng)物，希望在出現(xiàn)第一個(gè)腫瘤時(shí)，每組還有不少于 25只動(dòng)物。 ? 同時(shí)應(yīng)設(shè)陰性 (溶劑或賦形劑 )對(duì)照組。中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)來(lái)確定。低劑量組應(yīng)不影響動(dòng)物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和壽命，即不產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。d)。⑤ 最大可行劑量，受試物在飼料中最高含量為 5％。② 藥代動(dòng)力學(xué)終點(diǎn)，嚙齒動(dòng)物血漿AUC(時(shí)量曲線下面積 )為人的 25倍；③選擇吸收飽和劑量 。最大耐受劑量是由 90天毒性試驗(yàn)來(lái)確定的，此劑量應(yīng)使動(dòng)物體重減輕不超過(guò)對(duì)照組的 10％，并且不引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒癥狀或病理?yè)p傷。 61 ? （二）劑量選擇和動(dòng)物數(shù)量 ? 致癌試驗(yàn)一般設(shè)三個(gè)試驗(yàn)組。 ? 性別：為接近人類情況，應(yīng)使用同等數(shù)量的雌雄兩種性別的動(dòng)物。嚙齒類動(dòng)物對(duì)多數(shù)致癌物易感性較高，壽命相對(duì)較短，費(fèi)用也較低，生理和病理學(xué)資料較完備，因此使用最廣泛。但對(duì)生物技術(shù)制品，下列情況可考慮進(jìn)行致癌試驗(yàn)：生物學(xué)作用明顯不同于天然相應(yīng)物質(zhì)的制品；結(jié)構(gòu)明顯不同于天然相應(yīng)物質(zhì)的制品；在人體引起局部或全身濃度明顯增加的制品。 ? ⑥已具有致癌性資料的藥物的各種酸、堿、鹽應(yīng)提供其在藥物動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)或安全性方面沒(méi)有明顯改變的證據(jù)，對(duì)于酯和復(fù)雜的衍生物在確定是否需要進(jìn)行致癌試驗(yàn)時(shí)也應(yīng)有類似的資料，并應(yīng)個(gè)案討論。 ? ④擬用于病人預(yù)期壽命少于 3年的藥品不必進(jìn)行致癌試驗(yàn)，如腫瘤治療藥等。 ? ②已知屬于對(duì)人具有潛在致癌性的同類化合物；構(gòu)效關(guān)系提示具有致癌危險(xiǎn)性的物質(zhì) 3長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癌前病變 3原型或代謝產(chǎn)物在組織內(nèi)長(zhǎng)期蓄積，引起局部組織反應(yīng)或其他病理生理反應(yīng)的物質(zhì)。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 58 ? ICH(1995)根據(jù)已知的危險(xiǎn)因素、擬定的適應(yīng)癥和用藥時(shí)間，提出下列進(jìn)行新藥致癌性研究的范圍，避免不必要的試驗(yàn)。 第三節(jié) 觀察化學(xué)毒物致癌作用的基本方法 57 ? 一、用于致癌物篩選的短期試驗(yàn)： ? （二）哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)： ? 何時(shí)應(yīng)考慮進(jìn)行致癌性評(píng)價(jià)： ? ①人體可能長(zhǎng)期暴露于該化學(xué)物； ? ②該化學(xué)物或其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知致癌物相似； ? ③反復(fù)染毒毒性試驗(yàn)提示該化學(xué)物可能產(chǎn)生癌前病變。 ? 此四個(gè)試驗(yàn)不是成組試驗(yàn) ， 應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)選擇使用 。 典型的引發(fā)劑為二乙基亞硝胺 (DEN)， 促長(zhǎng)劑為苯巴比妥 (PB)。 轉(zhuǎn)化灶可用組織化學(xué)或免疫化學(xué)方法鑒定 。 ? 對(duì)大鼠進(jìn)行肝大部切除術(shù)后 ， 給以受試物 ， 一般可在 8～ 14周結(jié)束實(shí)驗(yàn) ， 觀察肝轉(zhuǎn)化灶生成 。典型的引發(fā)劑為烏拉坦，促長(zhǎng)劑為二丁基經(jīng)基甲苯 (BHT)。較敏感的小鼠為 A系小鼠。 典型的引發(fā)劑為致癌性多環(huán)芳烴 ， 促長(zhǎng)劑為佛波醇酯 (TPA)。 較受重視的短期致癌試驗(yàn)有下列四種： ? 1． 小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)： 于小鼠皮膚局部連續(xù)涂抹受試物 ，以觀察皮膚乳頭瘤和癌的發(fā)生 ， 一般 20周可結(jié)束實(shí)驗(yàn) ， 較敏感的小鼠為 SENCAR小鼠 。 ? ③ 原發(fā)性 DNA損傷： DNA加合物，鏈斷裂， DNA修復(fù)誘導(dǎo) (細(xì)菌 SOS反應(yīng)，大鼠肝 UDS誘導(dǎo) )， SCE試驗(yàn)； ? ④體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞， Balb/c 3T3細(xì)胞。 1 53 ? 根據(jù)致癌機(jī)制分類 ? carcinogens ?直接致癌物 ?間接致癌物 ?無(wú)機(jī)致癌物 ? genotoxic carcinogens ?促長(zhǎng)劑 ● 激素調(diào)控劑 ?細(xì)胞毒劑 ● 過(guò)氧化物酶體增殖劑 ?免疫抑制劑 ● 固態(tài)物質(zhì) ? ： 美舍吡倫 第二節(jié) 化學(xué)致癌物的分類 54 ? 一、用于致癌物篩選的短期試驗(yàn) ? （一）致突變?cè)囼?yàn)： ? ①基因突變?cè)囼?yàn)：鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn) )。234 ? 組 3， 現(xiàn)有的證據(jù)不能對(duì)人類致癌性進(jìn)行分類 。 ? 組 2