【正文】 導(dǎo)師的言傳身教、廣博的學(xué)識和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度將使我受益終生。 ndhF基因由于其堿基替換率高，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，已經(jīng)成為植物學(xué)專家非常重視的基因片段。特別是由于植物種間差異，不同物種之間只選取某單個基因其局限性就顯現(xiàn)出來了。鑒于此， DNA條形碼技術(shù)是遺傳關(guān)系分析非常有效的方式 。同一種生物在不同的生長時期 DNA序列信息是相同的、統(tǒng)一的、唯一的 , 即使經(jīng)過其他特別的加工 , 形態(tài)學(xué)特征發(fā)生了部分變化 , 都不會太影響 DNA序列信息 , 與傳統(tǒng)方法比較 , 檢測樣本的范圍得到了增加 。大多數(shù)種群的形態(tài)特征在進化樹上有著十分相近的形態(tài)學(xué)特征，傳統(tǒng)的經(jīng)典形態(tài)學(xué)鑒定分類技術(shù)已無法明確分別各自不同，而 DNA條形 碼技術(shù)的應(yīng)用為此提供了很好的技術(shù)平臺。 DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代植物分類非常有效的手段，在種間的遺傳多樣性分析方面具有重要的系統(tǒng)學(xué)價值。結(jié) 論 23 結(jié) 論 1 DNA條形碼技術(shù)是遺傳分析非常有效的方式 利用合適的分子標(biāo)記技術(shù)，可以非常有效的解決傳統(tǒng)的植物分類中所存在的一些問題。而且基因序列更新比較快，不同植物有很多條基因序列，導(dǎo)致難于選擇。本實驗所得分類結(jié)果與大致與傳統(tǒng)分類方法的結(jié)果相同，再次驗證 了通過 GenBank中的條形碼研究植物遺傳關(guān)系確實可行。GenBank 由于信息量大，涵蓋的物種范圍廣，更新速率快而成為非常好的數(shù)據(jù)庫來源。而 ndhF 基因比其他葉綠體編碼基因具有更高的堿基替代速率，再加上進化速率快和穩(wěn)定性好，以及方便快捷的優(yōu)勢，所以采用 ndhF 基因 DNA 序列研究 植物 遺傳關(guān)系是再好不過了，本實驗的結(jié)果也驗證可這一點。其中最被看好的是 rbcL基因和和 ndhF基因。在動物的遺傳關(guān)系分析中已經(jīng)廣泛使用并取得非常好效果的是細胞內(nèi)線粒體 COI 基因 ,但其在植物中的進化速率遠遠比在動物中的進化速率慢 ,只適用于一些低等的藻類。 圖 31 供試菊屬 19 種的相似性系統(tǒng)樹 植物 DNA 包含了植 物的所有遺傳信息，如果能對植物的所有 DNA 進行分析并加以記錄，以此作為遺傳關(guān)系分析的基礎(chǔ)其結(jié)果無疑是最準(zhǔn)確的最具有說服力的。 (3)序列長度適宜 , 比對比較容易 。 ndhF 作為植物候選 DNA 條形碼 , 具有以下優(yōu)勢 : (1)引物通用性能夠確保其在不同植物 3個屬 中的不同類群進行 PCR擴增 。 討論 ndhF作為候選 DNA 條形碼的優(yōu)勢 利用合適的分子標(biāo)記可有效的解決傳統(tǒng)植物分類中存在的復(fù)雜問題。 通過對 21 種狗尾草屬的遺傳相似性系數(shù)做進一步的 UPGMA 聚類分析 ，可得出它們的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 33 所示，從圖中可看出所有材料明顯分為兩組。 通過對 23 種紫草屬的遺傳相似性系數(shù)做進一步的 UPGMA 聚類分析，可得出它們的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 32 所示，從圖中可看出所有材料明顯分為兩組。 表 31：菊屬群種間遺傳距離 第三章 結(jié)果與討論 19 表 32：紫草屬群種間遺傳距離 表 33：狗尾草屬群種間遺傳距離 第三章 結(jié)果與討論 20 聚類分析 通過對 19 種菊屬的遺傳相似性系數(shù)做進一步的 UPGMA 聚類分析，可得出它們的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 31 所示，從圖中可看出所有材料明顯分為兩組。 21種狗尾草屬 ndhF基因的長度為 2020~2043bp，最短的 ， G+C含量為 40%~43%，多數(shù)為 42%。 第三章 結(jié)果與討論 18 第三章 結(jié)果與討論 結(jié)果分析 ndhF序列長度和 C+G 百分含量 19種菊屬 ndhF基因的長度為 1996~2174bp，最短的 ， G+C含量為 ％～ ％， 多數(shù)為 ％。 K2P模型是 DNA條形碼研究中使用最多的距離參數(shù) , 也是生命條形碼聯(lián)盟推薦的距離計算模型( 基于 K2P模型應(yīng)用 MEGA UPGMA樹。 采用 Clustal X (Thompson et al., 1997)在各個屬內(nèi)的物種間或同一物種的不同個間 (缺乏同屬種的數(shù)據(jù)時 )進行序列比對。運用 MEGA 4軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。 物種拉丁名 中文名 ndhF 長度 /bp (C+G)/% GenBank序號 ———— 538 % ———— 506 % ———— 560 % ———— 305 % ———— 524 % ———— 541 % ———— 536 % 第二章 實驗方法 16 ———— 540 % ———— 549 % ———— 539 % ———— 540 % ———— 538 % ———— 536 % ———— 559 % 變色紫草 596 % 管狀滇紫草 590 % 何首烏 589 % 軟紫草 587 % 小花紫草 541 % 紫草 541 % 狼紫草 540 % 紫草馬鈴薯 543 % 滇欖 575 % 表 23：狗尾草屬 21 種。 ndhF序列均來于GenBank數(shù)據(jù)庫，詳見表 2表 2表 23： 第二章 實驗方法 15 表 21：菊屬 19 種。我們從 NCBI數(shù)據(jù)庫中根據(jù)要分析的基因間序列尋找不同屬科植物的植物 DNA序列，根據(jù)課題題目我主要尋找了菊屬、紫草屬、狗尾草屬等植物科屬的一些序列片段，利用軟件和方法對這幾科植物進行分析。使用它我們可以編輯序列數(shù)據(jù)、序列比對、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、推測物種的進化距離等。多序列比較在分子生物學(xué)中是一個基本方法，用來發(fā)現(xiàn)特征序列，進行蛋白分類，證明序列間的同源性，幫助預(yù)測新序列二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)，確定PCR引物，以及在分子進化分析方面均有很大幫助。對于 DNA條形碼的研究和發(fā)展我們還有一定的路要走。 目前的研究 , 在整個生命世界 , 即使在整個植物界 , 找到一個基因或不太長的一個 DNA片段來區(qū)別每一個物種幾乎是不可能的 , 但是通過一個條形碼組合在基因組范圍內(nèi)實現(xiàn)階層條形碼 , 逐級縮小范圍 , 最后達到物種自動鑒定的目的是非常現(xiàn)實和可行的，生物信息學(xué)家和網(wǎng)絡(luò)工程師利用分類學(xué)家建立的條形碼數(shù)據(jù)庫開發(fā)出物種自動鑒定網(wǎng)絡(luò) 信息系統(tǒng) , 最終研制出便攜式的物種鑒定儀或 DNA barcoder裝備為大眾服務(wù)。生物信息學(xué)分析及與其它物種比對結(jié)果表明 , ndhF C290位編輯可能會影響該蛋白的正確折疊。然而 , 對于植物類群來說 , 目前還沒有找到一個理想的 DNA條形碼。 Erickson, 2020)、 matK (Chase et al.,2020。 Chase et al.,2020。Kress amp。而 DNA條形碼的應(yīng)用主要 集中在屬內(nèi)物種水平 , 因此只有針對具體類群進行探索研究 , 才可能為建立完整的條形碼數(shù)據(jù)庫起到積極有效的作用。 建庫后 , 驗證要以形態(tài)分類學(xué)結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)。此外 , 隨著生物多樣性保護、藥品和食品市場規(guī)范以及資源調(diào)查等方面的社會需求日益增長 , 在選擇 DNA條形碼時還要考慮各種具體需求的特殊性 (2) 對類群進行形態(tài)分類學(xué)修訂是開展植物 DNA條形碼研究的基礎(chǔ) , 而植物 DNA條形碼反過來可以檢驗形態(tài)分類 , 但目前傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和現(xiàn)代分子分類學(xué)還未能達到有機的結(jié)合。但根據(jù)目前的研究 , 即使對于動物來說 , 僅僅運用 COI這 一段線粒體DNA序列來實現(xiàn)對所有物種的鑒定仍然存在很大的不足和困難。 (1) 植物 DNA條形碼的選擇及其評價仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 就整體而言 , 在植物類群中條形碼的研究和應(yīng)用尚處于探索階段 , 稍落后于對動物類群的研究。因 此 , DNA條形碼概念在 2020年一經(jīng)提出 , 就得到了科技界和社會的積極響應(yīng)。 利用 DNA條形碼技術(shù)有望實現(xiàn)對物種的快速自動鑒定 , 從而克服傳統(tǒng)分類學(xué)研究方法的諸多缺陷 , 例如 : (1) 對各種形態(tài)特征齊全的標(biāo)本的依賴 , 對于被第一章 引 言 12 子植物來說 , 根據(jù)缺少花果的標(biāo)本 , 是很難正確鑒定種的 。它是利用一個或幾個標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段實現(xiàn)對物種快速、準(zhǔn)確的鑒定 , 還是一種有效識別隱存種的方法。也有研究表明應(yīng)用 AFLP標(biāo)記反而可以解決 nDNA和cpDNA序列難于澄 清的系統(tǒng)關(guān)系問題綜上所述 , 當(dāng)基于 DNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)樹因支持率低或存在沖突而并不能解決系統(tǒng)關(guān)系時 ,應(yīng)對序列數(shù)據(jù)進行全面的分析 , 包括對譜系重排、基源 /種源拷貝、重組子和假基因拷的檢驗和判斷 , 并結(jié)合已知的植物遺傳背景或進化史 , 采取相應(yīng)的有效措施進行改善 , 才能正確地揭示分類群內(nèi)的系統(tǒng)關(guān)系、推斷植物分化過程中經(jīng)歷的復(fù)雜進化史。如果隨機分割所獲得的支持率高于鄰接分區(qū)則意味著這些分類群存在快速輻射進化歷史 , 反之則是重組子對系統(tǒng)樹的干擾。 雖然序列 “噪音 ” (主要是 重組子的干擾 ) 和植物的快速進化都會引起相似的短枝 , 但可以通過檢驗加以區(qū)分。 也有學(xué)者建議結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)來解決。如基于多種 DNA序列的研究發(fā)現(xiàn)薔薇科蘋果亞科的各分類群經(jīng)歷了早期快速分化 , 表現(xiàn)為系統(tǒng)樹上的短枝。有時足夠的序列數(shù)據(jù)可能依然無法得到理想的系統(tǒng)樹分支 , 主要表現(xiàn)為某些分類群在系統(tǒng)樹上始終為短枝 , 其枝長為 0或接近 0, 暗示了組成短枝的植物存在快速分化 ( rap id radiation, 也稱適應(yīng)性輻射進化 ) , 即這些植物種在較短時間內(nèi)從祖先中分化出 , 在分子上的變異較小 , DNA序列上表現(xiàn)為同一核苷酸位點較第一章 引 言 11 短時間內(nèi)可能經(jīng)歷了多次突變 , 因此即使應(yīng)用足夠 的 DNA數(shù)據(jù)都無法解決其間的系統(tǒng)關(guān)系。即選用的 DNA片段在所研究的植物分類群中分化度過低 , 或數(shù)據(jù)中因存在較多的非信息位點 (如重組子的存在 ) , 可以相應(yīng)的通過增加植物分類群樣本、選用較快進化速率的 DNA片段及排除重組子并 采用最適宜的核苷酸替代模型進行計算得到改善。 系統(tǒng)關(guān)系無法得到解決 基于 DNA序列信息所構(gòu)建的系統(tǒng)樹可能存在分支不理想及支持率低 , 主要表現(xiàn)為多叉分支 poly2tomy (呈現(xiàn)為灌木叢狀 bush) 或短枝 ( short branch) , 從而無法達到解決系統(tǒng)關(guān)系的初衷。 而雜交及多倍化事件是植物進化過程中固有的。 基因位點的譜系重排和植物的雜交、多倍化事件作為引起系統(tǒng)關(guān)系結(jié)果沖突的兩大原因是可以區(qū)分的。譜系重排與種源 /基源拷貝區(qū)分問題有相似之處 , 但不同的是譜系重排的潛在威脅性隨所研究植物類群的分化時間越短而越大 , 因此在低水平的 系統(tǒng)發(fā)育研究中問題尤為突出。 第一章 引 言 10 譜系重排或譜系分選 ( inp lete lineage sorting, deep coalescence) 是后代對祖先多態(tài)等位基因進行隨機保留的結(jié)果 , 即后代不同物種攜帶了祖先的不同等位基因。其次 , 需考慮選用的 DNA片段的進化速率和進行系統(tǒng)分析時選用的替代模式是否妥當(dāng)。 (4) 基于葉綠體不同區(qū)域間的系統(tǒng)結(jié)果矛盾。 (2) 基于細胞質(zhì)和核基因序列的系統(tǒng)結(jié)果矛盾 ?；诓?同 DNA片段構(gòu)建的基因樹間可能會存在分歧 , 即某些個體或群體在不同的基因樹上的位置并不一致。因此 , 低拷貝核基因 (Low2copy nuclear gene, LCNG) 因其豐富的資源和較快的進速率被廣泛的開發(fā)和應(yīng)用。 由常用 DNA 片段分析向低拷貝核基因分析發(fā)展 長期以來 , 基于 DNA序列分析的植物系統(tǒng)學(xué)研究依賴于 cpDNA和 nrDNA的重復(fù)區(qū) , 特別是內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ( ITS) 的應(yīng)用最為頻繁。此外 ,不同植物分類群間 DNA片段的進化速率并不一致 , 且一段長度有限的序列有時無法提供足夠的信息位點。 Coleman, 1988) , 而核基因為雙親遺傳。 DNA 序列在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的發(fā)展 由 DNA 單一序列分析向多序列分析發(fā)展 在早期的植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中大多僅選用一種來源的 ( nDNA或 cpDNA) 甚至一個 DNA片段作為數(shù)據(jù)來源。 DNA 序列分析技術(shù)能應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育和進化研究中，該方法研究主要是通過提取植物的基因組 DNA, 設(shè)計引物并且擴增出適合進行系統(tǒng)進化研究的基因片段 ,進行 測序之后進行序列比對 , 建立取代模型然后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 , 用來分析物種間親緣關(guān)系和演化變異。 DNA 序列分析在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用 近些年來 ,分析許多存在爭議的系統(tǒng)學(xué)問題采用分子生物學(xué)手段 , 已經(jīng)獲得了很大的成功 。分子系統(tǒng)學(xué)主要的內(nèi)容包括分類學(xué)研究、系統(tǒng)發(fā)育重建和分子進化和種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析等幾個方面 , 經(jīng)常采用研究方法這幾種： DNA 序列分析、 RAPD、 RFLP、 AFLP、 ISSR 和同工酶標(biāo)記等 , 在這些的方法中 , 最主要、最常用的是 DNA 序列分析方法是種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析。 20世紀(jì) 70年代基因銀行的建立積累了大量的 DNA 序列信息 , PCR技術(shù)的不斷發(fā)展又使得在基因水平研究植物的遺傳變異成為可能 ,從而極大地推動了分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展 , 使得系統(tǒng)發(fā)育研究水平達到了一個相當(dāng)高的地步。 DNA 序列分析在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用和難題 分子系統(tǒng)學(xué) 近些年來隨著分子生物學(xué)的迅速