質(zhì)粒提取方法ppt課件-wenkub.com
2025-04-30 18:24 本頁面
【正文】 l70%乙醇漂洗沉淀，短暫離心。 [注意 ] ，置 Eppendolf管中 ：異戊醇，用振蕩器最大速度振蕩 1min，充分混勻。 1. 提取過程應盡量保持低溫。 將水相移入干凈 eppendorf管中 ,加入 ,顛倒混勻靜置 10分鐘，然后 12022g離心 10分鐘。 菌體沉淀重懸浮于 150μl溶液 Ⅰ 中 (需劇烈振蕩 ),室溫下放置 510分鐘。 ? 吸出上清移至另一個 Eppendolf 管中或用已滅菌的牙簽小心地將沉淀去除，加入 （ ）和 420μL冰凍的異丙醇，振蕩混勻，室溫放置 5 min。 ? 將沉淀回溶于 350μL STET ( mol/L NaCl， 10mmol/L Tris用無菌牙簽挑取單菌落接種到 5ml LB液體培養(yǎng)基 (含 50μg/ml Kan)中 ,37℃ 振蕩培養(yǎng)約 12小時至對數(shù)生長后期 。Cl()， 1mmol/L EDTA ()。高壓滅菌后儲存于 4℃ 冰箱中。 按體積/體積＝ 1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚 /氯仿 (1:1)。Cl ()和 TrisCl(), 15mmol/L NaCl中 ,配成 10mg/ml的溶液 ,于 100℃ 加熱 15分鐘 ,使混有的 DNA酶失活。 溶液 Ⅱ ： mol/L NaOH (臨用前用 510mol/L NaOH母液稀釋 )， 1％ SDS。 3mol/l NaAc ()： 50ml水中溶解 NaAc LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加 12g瓊脂粉 ,高壓滅菌。但質(zhì)粒 DNA的復性要快于細菌染色體 DNA。 變性 煮沸法： 將細菌懸浮于含 Triton X100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到 100℃ 使其裂解。在 ?這個狹窄的范圍內(nèi)，線性 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。當提取的質(zhì)粒 DNA電泳時 ,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉(zhuǎn)錄能力 ,能在子
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