質(zhì)粒dna提取純化與驗證-wenkub.com
2025-06-16 05:09 本頁面
【正文】 不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。loading buffer作用 ：增大樣品密度，確保DNA均勻進入樣品孔內(nèi)；以溴酚藍及二甲苯氰作為雙色電泳指示劑，使樣品呈現(xiàn)顏色，了解樣品泳動情況，使操作更為便利。如果不加氯仿，殘留的苯酚會阻礙酶切反應(yīng)等，且水飽和酚的密度略輕于水，苯酚相位于上層，不利于獲得含質(zhì)粒的水相，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。RNase：在質(zhì)粒DNA沉淀的同時，由于RNA與DNA性質(zhì)類似，RNA會同時沉淀。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。冰浴使反應(yīng)更充分。又SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，此外大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。TrisCl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。質(zhì)粒DNA條帶比較亮，其亮度大約為商品PUC19的34倍，故可以推測，提取的質(zhì)粒DNA濃度為PUC19濃度的34倍。4)RNA條帶：圖示中第15和16泳道為未加RNA酶的樣品，可見在500100bp范圍內(nèi)有寬而亮的條帶，該條帶為RNA條帶。在細菌體內(nèi)，質(zhì)粒DNA是以負超螺旋構(gòu)型存在的。其分子量比質(zhì)粒DNA大很多，所以在瓊脂糖凝膠中移動速度較慢，條帶靠近點樣孔。下面以我們組（JD4）為例，通過橫向?qū)Ρ龋缮现料聦γ恳粭l帶進行分析：1）蛋白質(zhì)條帶：點樣孔附近可以觀察到其周圍有微弱熒光，表明純化后的質(zhì)粒DNA仍含有少量蛋白質(zhì)。l）100ng100ng凝膠電泳觀察結(jié)果圖（三）結(jié)果分析凝膠電泳時，使用了2種DNA Maker，分別為位于第一泳道的λ/Hind III和位于最后一泳道的DL2000。加入溶液Ⅲ時，立即出現(xiàn)白色絮狀沉淀，經(jīng)輕柔混勻后，沉淀漂浮在EP管上部。1溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300 nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸分子。凝膠冷卻過程中，要自然冷卻，不要用冷水沖，否則會導(dǎo)致凝膠各部分不均勻，對電泳結(jié)果產(chǎn)生影響注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。 制備凝膠時，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時間過長，否則溶液將會爆沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度，可在微波爐中間歇性加熱，約沸騰三次后，至凝膠溶解即可。除用乙醇沉淀DNA外，還可使用0．6倍體積的異丙醇，但異丙醇也能將鹽等雜質(zhì)沉淀，所以沉淀需要在常溫下進行，并且時間不宜太長(限20 min內(nèi))。因此，操作時一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分作用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。為獲得高純度質(zhì)粒DNA，必須徹底除去雜蛋白、染色體DNA和RNA?！咀⒁馐马棥吭诮泳鷷r，注意無菌操作，物品應(yīng)在酒精燈火焰上方無菌區(qū)域內(nèi)。凝膠電泳分離質(zhì)粒 1）制膠：1% 瓊脂糖凝膠：，加40ml 1TAE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，三角瓶放在手面可堅持1min即可，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1TAE），即可上樣。提取質(zhì)粒 1）向離心管中加入溶液Ⅰ（），漩渦混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液Ⅱ（），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液Ⅲ（），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min；離心管配平，12000rpm離心15min,取上清至新50ml離心管（記體積為v1) 2）加入2v1冰乙醇，顛倒混勻，20℃保存30min，12000rpm離心15min,棄上清液,將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。溶液Ⅲ：5M醋酸鉀（KAc）緩沖液60ml，溶液中濃度K+3M,Ac5M。(1M TrisHCl， pH ； EDTA 10ml pH ，加ddH2O至500ml。 6)溫度：瓊脂糖凝膠電泳時，不同大小D
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