質粒dna制備-wenkub.com
2025-07-29 14:25 本頁面
【正文】 ? ２ ） 在十分偶然的情況下 ， 個別小量制備物會出現(xiàn)無質粒ＤＮＡ的現(xiàn)象 。 ? 通過離心 ， 可去除大部分細胞碎片染色體 DNA、 RNA及蛋白質 ， 質粒 DNA尚在上清中 ， 再用酚 、 氯仿抽提進一步純化質粒 DNA。所以離心收集細菌時，上清液應去除干凈，最好用 STE或生理鹽水再懸浮，漂洗菌體 12次。 ? 但是暴露在強堿性環(huán)境中時間過長 ， 共價閉合環(huán)狀質粒 DNA可發(fā)生不可逆的變性 ， 導致內切酶切割困難 ， 質粒 DNA遷移速度降低 1倍左右 ， EB染色效率低 。 ? 在溶菌酶消化細菌壁與膜后 ， 再加 SDS解聚蛋白質與 DNA的結合 。 ? 若用 CsClEB梯度平衡超速離心 ， 糖類的密度平衡區(qū)域與閉環(huán)共價質粒 DNA帶非常鄰近 ， 在抽取閉環(huán)質粒 DNA時 ， 不可避免地污染有糖類 ， 它們可抑制許多 DNA限制性內切酶的活性 。如離子交換層析法或排阻層析法，分級聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質量的質粒DNA。 ? 不同方法各有利弊，一般要根據質粒性質、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。 所以使用氯霉素的主要目的 ， 是在不減低質粒產量的前提下 ， 減少細菌的培養(yǎng)體積和細菌的數量 ． ? 有時質粒在細菌中的擴增狀況很差 ， 常是由于質粒攜帶外源基因或質粒分子量過大所致 。質粒 DNA的復制不受影響而大量擴增。 2. pUC系統(tǒng) ? 如 pUCl8和 pUCI9，由 pBR322的 ampr基因和復制子，以及大腸桿菌部分 1acZ基因和一個多種限制性內切酶單一位點的接頭構成，全長 2 666bp， pUCl8和 pUCl9所含多位點接頭的方向正好相反。 6. 限制性內切酶單一切口 ? 在質粒復制子以外的部位具有一種或多種限制性內切酶的單一切口，便于外源基因的插入。 ? ampr基因或 tetr基因若被外源基因插入，便失去相應的抗藥性，便于分子克隆的篩選。 4. 轉移性 ? 在自然條件下，很多質粒都可以通過一種稱為細菌接合的作用轉移到新宿主內。 細菌生長幾代之后 ， 占少數的質粒將會喪失殆盡 ， 在原始細胞的后代中可含有兩種質粒中的任意一種 ， 但不會兼而有之 。 ? 利用同一復制系統(tǒng)的不同質粒不能穩(wěn)定地和平共處 ， 可稱之為不相容質粒 ， 當兩個上述質粒被導入同一細胞時 ， 它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭 。 2. 含有高效的自主復制成分 ? 質粒的復制與宿主細胞的繁殖不相關，在抑制細菌蛋白質合成時，細菌染色體 DNA停止復制，但這種質?？衫^續(xù)利
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