20xx年醫(yī)學(xué)專題—培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇-資料下載頁(yè)
2024-11-19 04:37本頁(yè)面
【正文】 果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。 因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對(duì)細(xì)胞具有毒性（但在4℃時(shí)毒性大為減弱）。所以，冷凍保護(hù)液的滴加全過程必須在4℃冰浴中進(jìn)行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時(shí)間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡。四、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 （一）非玻璃化凍存的復(fù)蘇方法 主要材料 （1） 儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機(jī)； （2） 培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。 復(fù)蘇過程 （1） 調(diào)配37℃～40℃的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至37℃～40℃； （2） 從液氮中取出凍存管，立即投入37℃～40℃ 溫水中迅速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解； （3） 將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻； （4） 將細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min，棄上清夜； （5） 向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。 結(jié)果 復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。 討論 細(xì)胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。實(shí)驗(yàn)人員在復(fù)蘇細(xì)胞過程中，同樣應(yīng)具有自我保護(hù)意識(shí)，避免被液氮凍傷。 （二）玻璃化凍存的復(fù)蘇方法 以下以人的單核細(xì)胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。 主要材料 （1）設(shè)備：高速離心機(jī)； （2）培養(yǎng)用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。 操作過程 (1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復(fù)溫速率約560℃/min。一次可以進(jìn)行多個(gè)凍存管的復(fù)蘇；(2) 將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中； (3) 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。，，最后30min以1ml/min的速度加入。全過程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行； (4) 將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用于培養(yǎng)。 結(jié)果 復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。 討論 復(fù)蘇時(shí)，冷凍保護(hù)液的稀釋及去除過程與凍存前冷凍保護(hù)液的滴加過程一樣，不能在室溫下而必須在4℃冰浴中進(jìn)行，避免在室溫下冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。稀釋過程也要緩慢進(jìn)行，保證有足夠的時(shí)間讓冷凍保護(hù)劑從細(xì)胞內(nèi)滲出，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。內(nèi)容總結(jié)
（1）培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇
一、概述 Spallanzani（1776）最早發(fā)表了冷“處理”對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人驚奇的現(xiàn)象，那些原本已經(jīng)不動(dòng)了的精子又“復(fù)活”了，就好象是剛從輸精管排出來的一樣，冷處理延長(zhǎng)至數(shù)十分鐘，情況依然如此
（2）同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷
畢業(yè)設(shè)計(jì)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1