20xx年醫(yī)學專題—培養(yǎng)細胞的冷凍保存與復蘇-資料下載頁
2024-11-19 04:37本頁面
【正文】 果，不需要復雜的儀器設備，具有液氮儲存設備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應用，但很少應用于一般細胞的凍存。這可能與需要配制較復雜的凍存液以及冷凍前和復蘇后較煩瑣的操作有關。 因為玻璃化冷凍保護液中的冷凍保護劑的濃度較高，室溫下對細胞具有毒性（但在4℃時毒性大為減弱）。所以，冷凍保護液的滴加全過程必須在4℃冰浴中進行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細胞外產生很高的滲透壓，造成細胞膜的損傷，導致細胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護劑有足夠的時間緩慢滲透到細胞內，達到細胞內外的平衡。四、凍存細胞的復蘇 （一）非玻璃化凍存的復蘇方法 主要材料 （1） 儀器設備：恒溫水浴箱、高速離心機； （2） 培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。 復蘇過程 （1） 調配37℃～40℃的溫水，或將恒溫水浴箱的溫度調節(jié)至37℃～40℃； （2） 從液氮中取出凍存管，立即投入37℃～40℃ 溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解； （3） 將細胞凍存懸液轉移到離心管內，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻； （4） 將細胞懸液經800～1000r/min離心5min，棄上清夜； （5） 向細胞沉淀內加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉移到培養(yǎng)瓶內，補足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。 結果 復蘇后的細胞應該保持其凍存時的活力，活細胞數達90%以上。 討論 細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護液，防止冷凍保護劑對細胞產生毒性。實驗人員在復蘇細胞過程中，同樣應具有自我保護意識，避免被液氮凍傷。 （二）玻璃化凍存的復蘇方法 以下以人的單核細胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。 主要材料 （1）設備：高速離心機； （2）培養(yǎng)用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。 操作過程 (1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復溫速率約560℃/min。一次可以進行多個凍存管的復蘇；(2) 將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細胞凍存懸液轉移到50ml離心管中； (3) 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。，，最后30min以1ml/min的速度加入。全過程約為65min，都在冰浴中進行； (4) 將稀釋后的細胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細胞，用于培養(yǎng)。 結果 復蘇后的細胞應該保存其凍存時的活力，活細胞數達90%以上。 討論 復蘇時，冷凍保護液的稀釋及去除過程與凍存前冷凍保護液的滴加過程一樣，不能在室溫下而必須在4℃冰浴中進行，避免在室溫下冷凍保護劑對細胞產生毒性。稀釋過程也要緩慢進行，保證有足夠的時間讓冷凍保護劑從細胞內滲出，以達到細胞內外的平衡，避免高滲透壓的損傷。內容總結
（1）培養(yǎng)細胞的冷凍保存與復蘇
一、概述 Spallanzani（1776）最早發(fā)表了冷“處理”對“細胞”生命活動影響的報道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發(fā)現了一個令人驚奇的現象，那些原本已經不動了的精子又“復活”了，就好象是剛從輸精管排出來的一樣，冷處理延長至數十分鐘，情況依然如此
（2）同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷
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