【正文】 分裂細胞數(shù) /總細胞數(shù) 100%第一百五十二 頁 ，共一百八十七 頁 。細胞周期（ 1）放射性核素標(biāo)記自顯影用 3H標(biāo)記脫氧 (tuōyǎng)胸腺嘧啶核苷 處理 30min后，每間隔 30min取材，直到 48h為止，觀察和計算細胞分裂相出現(xiàn)時間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪圖分析。（ 2）流式細胞儀測定法第一百五十三 頁 ，共一百八十七 頁 。培養(yǎng)細胞活力 (hu243。l236。)測定v 細胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 v 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。1 、細胞克隆形成率實驗克隆形成試驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個細胞在體外增殖 6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰? v 克隆形成率＝克隆形成數(shù)／接種 (jiēzh242。ng)細胞數(shù)， 通過計數(shù)克隆形成率，可對單個細胞的增殖潛力作定量分析，了解細胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應(yīng)性?？寺⌒纬陕矢哒咂洫毩⑸婺芰?。這種方法常用于抗癌藥物敏感性試驗、腫瘤放射生物學(xué)試驗等。常用的方法有平板克隆形成試驗和軟瓊脂克隆形成試驗。v 缺點：操作繁瑣v 優(yōu)點：精確、可靠第一百五十四 頁 ，共一百八十七 頁 。 臺盼藍法v 活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占v 細胞中的百分比表示細胞活力 (hu243。l236。) v 臺盼藍排斥試驗：（ 1）臺盼藍濃度： 母液： 4%，用雙蒸水配制；工作液： %，用 PBS稀釋。（ 2）稀釋倍數(shù)： 臺盼藍工作液：細胞懸液 =1： 9（ 3）結(jié)果判斷：鏡下觀察見死細胞被染成淡蘭色，活細胞不著色。（ 4）細胞活力的計算活細胞率 =活細胞總數(shù) /（活細胞總數(shù) +死細胞總數(shù)） ?100%第一百五十五 頁 ，共一百八十七 頁 。第一百五十六 頁 ，共一百八十七 頁 。（三）培養(yǎng)細胞 (x236。bāo)種屬鑒定方法熒光抗體染色鑒別細胞的種屬v ? 間接熒光抗體染色技術(shù) — 采用兔產(chǎn)生的特異性抗血清標(biāo)記待測細胞和陽性細胞、陰性 (yīnx236。ng)細胞。加標(biāo)記有熒光染料（ FITC）的山羊抗兔免疫球蛋白抗體。后加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細胞上，借助熒光即可看到抗原－抗體復(fù)合物。第一百五十七 頁 ，共一百八十七 頁 。同工酶譜系鑒別細胞種屬v 通過確定三種同工酶系統(tǒng)（ 6磷酸葡萄糖脫氫酶（ G6PD），乳酸 (rǔ suān)脫氫酶（ LDH）和核苷磷酸化酶（ NP）的垂直淀粉膠電泳的遷移率，可以鑒定細胞系的種屬來源。該法有高度的可靠性，簡單、重復(fù)性好。利用同工酶分析檢驗細胞的交叉污染v G6PD、 LDH、 NP的電泳遷移率差異不僅可用來鑒別細胞系所屬種屬，還可查出種內(nèi)細胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。第一百五十八 頁 ，共一百八十七 頁 。染色體分析v?多數(shù)情況下，即使 (j237。shǐ)普通顯微鏡觀察技術(shù)，液足以鑒定不同種的染色體結(jié)構(gòu)的差異。v?染色體核型分析足以鑒定不同種間細胞系之間的污染。親緣關(guān)系近的靈長類細胞系之間和人癌細胞系之間的比較可用 Giemsa顯帶分析。第一百五十九 頁 ，共一百八十七 頁 。人主要組織相容性抗 原v ?人主要組織相容性抗原（ HLA抗原）存在大多數(shù)有核細胞膜上，常用抗原檢測是用補體依賴細胞毒試驗，用拒染來鑒定細胞活性 。原理： HLA抗體與淋巴細胞表面的相應(yīng)抗原結(jié)合后激活補體，導(dǎo)致細胞膜損傷，通透性增 強 (zēngqi225。ng)，染料進入細胞，細胞死亡。在倒置相差顯微鏡下觀察，著色的細胞為死亡細胞，視野下有較多細胞死亡為陽性 。第一百六十 頁 ，共一百八十七 頁 。核酸技術(shù)用重組 (zh242。nɡzǔ)DNA技術(shù)和 DNA探針技術(shù)鑒定和定量培養(yǎng)細胞中等位基因的多態(tài)性。第一百六十一 頁 ，共一百八十七 頁 。? 腫瘤細胞 (x236。bāo)的體外培養(yǎng)與建系過程 ? 上皮細胞培養(yǎng) ? 表皮組織培養(yǎng)? 肌肉組織培養(yǎng)? 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)第四節(jié) 動物細胞體外培養(yǎng) (p233。iyǎng)舉例 第一百六十二 頁 ，共一百八十七 頁 。腫瘤細胞的體外培養(yǎng)的歷史v 1906年， Beebe和 Ewing最早成功培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細胞；v 1911年， Carrel最先在體外培養(yǎng)了纖維 (xiānw233。i)軟骨瘤及黑色素瘤細胞。v 1952年， Gey首先成功地建立了世界上第一個細胞系 —— 來源于子宮頸癌細胞的細胞系，并且是惡性腫瘤細胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的細胞轉(zhuǎn)向上皮源性細胞。v 后來，口腔癌、喉癌、肺癌等細胞系相繼建立。迄今為止，全球范圍內(nèi)建立的細胞系目前已經(jīng)超過三位數(shù)。第一百六十三 頁 ，共一百八十七 頁 。發(fā)展 (fāzhǎn)成就v 在培養(yǎng)的腫瘤細胞類型上，經(jīng)歷了從間充質(zhì)源性的細胞轉(zhuǎn)上皮源性細胞、再由神經(jīng)外胚層源性到造血源性的發(fā)展歷程。v 在培養(yǎng)方法上，經(jīng)歷了從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細胞系的建立的發(fā)展過程。v 培養(yǎng)成分上，由采用純血清培養(yǎng)到含血清培養(yǎng)基、再到無血清培養(yǎng)基三個階段。v 在對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞生物學(xué)特性 (t232。x236。ng)研究水平上，經(jīng)歷了從細胞水平到亞細胞水平，再到酶和分子水平的發(fā)展時期。v 國內(nèi)已建立的腫瘤細胞系主要有：來自白血病患者的淋巴樣的 J6懸浮生長型的胃癌 SL79上皮型的肝癌 SMMC772鼻咽癌 CNE成骨肉癌 OC861結(jié)腸癌 THC8910,以及多形型的胸膜間皮癌 SMC1等等。第一百六十四 頁 ，共一百八十七 頁 。上皮組織的體外培養(yǎng) v 體外培養(yǎng)細胞生長的形態(tài)特性 細胞排列緊密，細胞形態(tài)較為一致 (yīzh236。)，細胞間質(zhì)少 上皮組織的體外培養(yǎng)特性：依賴性、接觸抑制性、細胞連接、貼壁生長第一百六十五 頁 ，共一百八十七 頁 。表皮組織的體外培養(yǎng) v * 表皮細胞分兩類： v 角質(zhì)形成 (x237。ngch233。ng)細胞、非角質(zhì)形成 (x237。ngch233。ng)細胞 v * 角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)技術(shù)： v 1975年，萊因沃德（ Rheinwald）和格林（ Green）創(chuàng)立飼養(yǎng)層培養(yǎng)法第一百六十六 頁 ，共一百八十七 頁 。v 上皮細胞培養(yǎng)液：近年來，國外一些公司研制了多種成品上皮細胞培養(yǎng)液，例如適用于角化上皮細胞的KGM，適用于一般表皮細胞的 EGM等，使用很方便。v 結(jié)果及鑒定培養(yǎng)的細胞必須鑒定，以排除間充質(zhì)細胞混雜。表皮細胞對角蛋白特異性單克隆抗體反應(yīng)陽性，間充質(zhì)細胞對波型絲特異性單克隆抗體反應(yīng)陽性。培養(yǎng)初期 (chūqī)可觀察到上皮細胞的纖維樣細胞混雜生長經(jīng)數(shù)次傳代后纖維樣細胞逐漸消失。v 【 3T3細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)和照射處理】3T3細胞是 Swiss鼠成纖維細胞，在表皮細胞培養(yǎng)中經(jīng)常用照射處理過的 3T3細胞作滋養(yǎng)層，3T3細胞一般應(yīng)維持在低密度條件下培養(yǎng)。在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種 5106~105個即可，培養(yǎng)3~4d可獲得 3~5106個細胞，可再行胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。如果用于照射處理，將胰蛋白酶消化的細胞懸浮于含 10%胎牛血清的 MEM培養(yǎng)液中，在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種 106個細胞，在鈷源下給予 60Gy（ 6,000rads）照射劑量，培養(yǎng)使細胞貼壁，更換培養(yǎng)液，待用。第一百六十七 頁 ，共一百八十七 頁 。肌肉組織的體外培養(yǎng) v （ 1）肌肉組織的特點 v 肌肉組織（肌組織）細胞間結(jié)締組織少、血管 (xu232。guǎn)和神經(jīng)豐富。肌細胞長梭形，又稱肌纖維。 v 肌肉組織培養(yǎng)：指將肌肉組織植塊或分散的肌肉細胞在離體條件下生存、生長或發(fā)育的技術(shù)。 v （ 2）骨骼肌的培養(yǎng)第一百六十八 頁 ，共一百八十七 頁 。神經(jīng)組織 (zǔzhī)的體外培養(yǎng) v 神經(jīng)組織包括：神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞 v 1907年，哈里森首創(chuàng)培養(yǎng)方法。經(jīng)歷了組織塊培養(yǎng) →分離細胞培養(yǎng) → 單一型細胞階段第一百六十九 頁 ，共一百八十七 頁 。神經(jīng)原細胞培養(yǎng)v 神經(jīng)原細胞培養(yǎng)需要極高的營養(yǎng)條件，培養(yǎng)器皿也需要經(jīng)過特殊處理，神經(jīng)軸突在膠原和聚 L—賴氨酸（ PolyLlysine）溶液中可以旺盛生長，神經(jīng)生長因子（ NGF）可促進神經(jīng)原的生長。v 　　從出生 4~8d的大鼠腦組織取材培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神經(jīng)原細胞，可獲得特征明顯的腦神經(jīng)細胞?；痉椒ㄊ侨⌒律笫竽X，切成小塊，用 HBSS胰酶消化， 37℃ 15min，將細胞懸液接種于聚 L— 賴氨酸覆蓋內(nèi)底面的培養(yǎng)器皿內(nèi)進行培養(yǎng)?！居闷贰縱 DMEM培養(yǎng)液：其中加有 10%熱滅胎牛血清， 30mmol/L葡萄糖， L— 谷氨酰胺， mol/LKCL， 100mU/L胰島素， 7μmol/LP— 氨基苯酸， 100μg/ml慶大霉素v Hands平衡 (p237。ngh233。ng)鹽液，其中加入牛血清白蛋白 3g/L(HBSS)v 聚 L— 賴氨酸，分子量大于 300,00v 胞嘧啶阿拉伯糖v Ⅱ 型胰蛋白酶（ %，溶于 HBSS）v 硅膠（ Aquasil,Pierce42799）v ， Pasteur滴管， 10ml移液器（無菌）v 12ml和 50ml無菌試管、無菌手術(shù)器械、水浴箱【鑒定方法】v 　　用神經(jīng)原特異性烯醇抗體或破傷風(fēng)毒素作為標(biāo)記物，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測可判定神經(jīng)原細胞；用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白作為標(biāo)記物可判斷混雜在其中的膠質(zhì)細胞。第一百七十 頁 ，共一百八十七 頁 。v 細胞培養(yǎng)目的與用途　　 1.藥物研究與開發(fā) 　 (1)新藥篩選 :如化學(xué)合成藥物藥效研究 ,中藥有效成分篩選與鑒定等 .　　 (2)疫苗研究與開發(fā) :如病毒性疫苗的研究與開發(fā) (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 .　　 (3)基因工程藥物研究與開發(fā) :如干擾素研究與開發(fā) ,細胞生長因子研究與開發(fā)等 .　　 (4)細胞工程藥物研究與開發(fā) :生物活性多肽研究與開發(fā) ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā) .　　 (5)單克隆抗體制備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 .　　基礎(chǔ)研究 　　 (1)藥物作用機理 　　 (2)基因功能 　　 (3)疾病發(fā)生機理 　　 2,生物制藥 　　 (1)疫苗生產(chǎn) :如病毒性疫苗 (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 .　　 (2)基因工程藥物生產(chǎn) :如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價值 (ji224。zh237。)的一些細胞生長因子如干擾素 ,粒細胞生長因子 ,胸腺肽等 (3)診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn) 　　 (4)細胞工程藥物生產(chǎn) :生物細胞內(nèi)的一些生物活性多肽 ,生物活性物質(zhì)等 第一百七十一 頁 ，共一百八十七 頁 。動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 * 目前存在的主要問題 (w232。nt237。):（ 1）細胞密度低 ,產(chǎn)物濃度低。（ 2）細胞群體在大規(guī)模 ,長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力易丟失 ,或產(chǎn)物活性易降低。（ 3）動物細胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體昂貴。（ 4）目前對細胞代謝和生長動力學(xué)的研究比較欠缺。（ 5）在線監(jiān)控水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。第一百七十二 頁 ，共一百八十七 頁 。第五節(jié) 細胞 (x236。bāo)同步化細胞 (x236。bāo)同步化培養(yǎng)指自然或人工方法獲得細胞群體 (qntǐ)的細胞周期同步化生長。 第一百七十三 頁 ，共一百八十七 頁 。細胞 (x236。bāo)同步化培養(yǎng)指自然或人工方法獲得細胞群體 (qntǐ)的細胞周期同步化生長。 篩選 (shāixuǎn)同步化細胞 誘導(dǎo)同步化細胞 M期細胞震蕩脫落法 離心洗脫法 梯度沉降法 血清饑餓法 異亮氨酸營養(yǎng)缺乏法 DNA合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法 第一百七十四 頁 ，共一百八十七 頁 。第六節(jié) 器官 (q236。guān)培養(yǎng)v定義 (d236。ngy236。)與特點 v器官培養(yǎng)技術(shù)第一百七十五 頁 ，共一百八十七 頁 。1 定義與特點 v 器官培養(yǎng)：取出動物 (d242。ngw249。)器官或進一步修整成器官型植塊，將其培養(yǎng)使其存活和生長的過程。 v 1897年，利奧勃（ Leob）首創(chuàng)。第一百七十六 頁 ，共一百八十七 頁 。人體器官培養(yǎng)的共同點： v （ 1）培養(yǎng)對象為胚胎組織 (zǔzhī)的某一器官或非胚胎組織 (zǔzhī)器官的一部分 v （ 2）被培養(yǎng)對象浸泡在培養(yǎng)液中 v （ 3）培養(yǎng)器官從培養(yǎng)液中獲氧及養(yǎng)料，同時排廢物第一百七十七 頁 ，共一百八十七 頁 。器官培養(yǎng)特征 v （ 1）被培養(yǎng)的器官在體外存活 (cn hu243。)較長時間，并保存相對正常的功能，器官內(nèi)的細胞有正常的代謝甚至增殖。而器官保存無細胞增殖 v （ 2）被培養(yǎng)物為一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分，如肝 v （ 3）器官培養(yǎng)不能從一個變成多個，而細胞培養(yǎng)過程中有細胞量的增加第一百七十八 頁 ，共一百八十七 頁 。2 器官培養(yǎng)技術(shù) v 器官培養(yǎng)可分為：胚胎器官培養(yǎng)和成年器官培養(yǎng) v 培養(yǎng)原則 (yu225。nz233。)： ① 提供充足的氧氣和養(yǎng)料，及時排除廢物。 ② 抑制細胞從植塊向外遷移第一百七十九 頁 ，共一百八十七 頁 。傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 （ 1）表玻璃 (bō l237。)器官培養(yǎng)法 v 1929年，費爾（ Fell）和魯濱遜 （ Robinson）建立 （ 2）瓊脂凝膠培養(yǎng)法 v沃爾夫（