動物細胞培養(yǎng)常用技術-資料下載頁
2025-08-04 14:27本頁面
【正文】 在培養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。支原體檢測方法和處理 1）熒光技術檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結合，可根據(jù)細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實驗室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交： 檢測完畢后，所有實驗用具均應經過高壓消毒處理。5）污染支原體后的處理： 抗生素處理：如加入泰樂菌素等。 共培養(yǎng)法：與巨噬細胞共培養(yǎng)。 重新克隆法：抗生素處理后，將細胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4~5周后，重復克隆2次。 過濾法：。污染病毒的檢測 1）致細胞病變效應（CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測2）血細胞吸附試驗；3）雞胚接種。 細胞間交叉污染為避免細胞間交叉污染，應注意：了解各細胞系的特征；培養(yǎng)各細胞系的操作手續(xù)要快速；培養(yǎng)各細胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；吸過培養(yǎng)液和細胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的瓶內；經常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進行冷凍保存，在需要時再復溫融解進行體外培養(yǎng)（復蘇）。要獲得好的凍存與復蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復溫速率、冷凍保護劑，冷凍保存溫度。 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，是活細胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。 不同細胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細胞、酵母、℃、7℃和200/分。所以一種細胞冷凍保存之前要測試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。 復溫速率 復溫速率是指細胞復蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細胞復蘇時，復溫速率不當也會降低冷凍存活率。一般來說復溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內要完成復溫。冷凍保護劑 冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質，常被加到一定的溶液中進行配制，作為冷凍保護液。紅細胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳類動物細胞懸浮在水或簡單的鹽溶液中而不加冷凍保護劑，以最適的冷凍速率冷凍保存可獲得活的凍存物。 對大多數(shù)有核哺乳類動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。 目前冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子的物質，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。 冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細胞生化反應極其緩慢或停止，但經長期保存和復蘇后仍能保持正常的結構和功能。從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。
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