動物細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)-資料下載頁
2025-08-04 14:27本頁面
【正文】 在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。支原體檢測方法和處理 1）熒光技術(shù)檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實驗室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交： 檢測完畢后，所有實驗用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理。5）污染支原體后的處理： 抗生素處理：如加入泰樂菌素等。 共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。 重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4~5周后，重復(fù)克隆2次。 過濾法：。污染病毒的檢測 1）致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測2）血細(xì)胞吸附試驗；3）雞胚接種。 細(xì)胞間交叉污染為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意：了解各細(xì)胞系的特征；培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；吸過培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的瓶內(nèi)；經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時再復(fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）。要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，是活細(xì)胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細(xì)胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。 不同細(xì)胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、℃、7℃和200/分。所以一種細(xì)胞冷凍保存之前要測試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。 復(fù)溫速率 復(fù)溫速率是指細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時，復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低冷凍存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內(nèi)要完成復(fù)溫。冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常被加到一定的溶液中進(jìn)行配制，作為冷凍保護(hù)液。紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳類動物細(xì)胞懸浮在水或簡單的鹽溶液中而不加冷凍保護(hù)劑，以最適的冷凍速率冷凍保存可獲得活的凍存物。 對大多數(shù)有核哺乳類動物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。 目前冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。 冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長久保存細(xì)胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢或停止，但經(jīng)長期保存和復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。
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