【文章內(nèi)容簡介】 3050倍體積 %濃度胰蛋白酶溶液37℃ 消化 3060min，每 510min搖動一次第八十二 頁 ，共一百八十七 頁 。相關酶類包括：胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點選擇(xuǎnz233。)使用第八十三 頁 ，共一百八十七 頁 。原代培養(yǎng)與檢查 v 接種、培養(yǎng) v ↓ v 常規(guī) (ch225。ngguī)檢查（檢查細胞形態(tài)及活力、檢查營養(yǎng)液 pH及污染）第八十四 頁 ，共一百八十七 頁 。傳代培養(yǎng)技術? 傳代：當原代培養(yǎng)成功后，細胞分裂增殖成片時，需要對其分離重新 (ch243。ngxīn)培養(yǎng)，這一操作過程成為傳代。? 第一次傳代時間 ： 有 8090% 或剛剛全部匯合的細胞是傳代的理想時期。過早產(chǎn)量不足，過晚細胞狀態(tài)不佳。 第八十五 頁 ，共一百八十七 頁 。基本 (jīběn)步驟： 吸出培養(yǎng) (p233。iyǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng) (p233。iyǎng)液 ↓ 加入 (jiār249。)胰蛋白酶和 EDTA混和液 (以能覆蓋整個瓶底為準） ↓ 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 ↓ 吸管輕輕吹打使細胞分散成懸液，計數(shù) ↓ 重新接種 于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)1）貼壁生長細胞傳代 ↓ 培養(yǎng)第八十六 頁 ，共一百八十七 頁 。第八十七 頁 ，共一百八十七 頁 。2）懸浮生長細胞 (x236。bāo)傳代離心法傳代 (chu225。n d224。i) 直接 (zh237。jiē)傳代法 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 800g）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除 l／ 2一 2／ 3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。第八十八 頁 ，共一百八十七 頁 。（三）細胞 (x236。bāo)純化第八十九 頁 ，共一百八十七 頁 。（四）細胞 (x236。bāo)的凍存復蘇v細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。凍存意義：1）長期保存細胞；2）防止細胞老化；3）減少人力 (r233。nl236。)、經(jīng)費，減少污染。第九十 頁 ，共一百八十七 頁 。凍存和復蘇 (f249。sū)的原則：慢凍快融v 當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成 (x237。ngch233。ng)冰晶。v 在細胞凍存時要盡可能均勻地減少細胞內(nèi)水分， 減少細胞內(nèi)冰晶的形成是減少細胞損傷的關鍵。 v 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。v 復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。第九十一 頁 ，共一百八十七 頁 。保存細胞三要素：營養(yǎng) (y237。ngyǎng)、保護劑和低溫低溫保護劑的應用v 在細胞凍存時加入保護劑，能大大提高凍存效果。v 常用 (ch225。nɡy242。nɡ)的低溫保護劑是 甘油或 DMSO，滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。v 保護劑的濃度在 5~15%之間，常用 10%。第九十二 頁 ，共一百八十七 頁 。慢凍程序 (ch233。ngx249。)v 標準程序：v 當溫度在 25℃ 以上時， 1～ 2℃ /minv 當溫度達 25℃ 以下時， 5～ 10℃ /minv 當溫度達 100℃ 時，可迅速放入液氮中v 簡易程序：v 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以 線繩，通過線繩將 紗布袋固定 (g249。d236。ng)于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降 1～ 2 ℃ 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停 30分鐘后，直接投人液氮中。第九十三 頁 ，共一百八十七 頁 。細胞 (x236。bāo)凍存方法1預先配制凍存液： 含 20%血清培養(yǎng)基 9份DMSO1份2取對數(shù)生長期細胞 (x236。bāo)，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液 ,用吸管吹打制成細胞 (x236。bāo)懸液（ 1106～ 5106細胞 /ml)3分裝：每瓶 1ml，密封后標記冷凍細胞名 稱和冷凍日期。凍存 1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于 4℃ 10分鐘 →20 ℃ 30分鐘 →80 ℃ 16～ 18小時(或隔夜 )→ 液氮槽長期儲存。 20℃ 不可超過 1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以 1～ 3℃ /分鐘之速度由室溫降至 (80℃ 以下 )120℃ ，再放在液氮長期儲存。適用于懸浮 (xu225。nf)型細胞與 hybridoma之保存。 第九十四 頁 ，共一百八十七 頁 。v凍存要點：1）慢凍2）取對數(shù)生長期細胞進行 (j236。nx237。ng)凍存，無微生物污染；3）細胞濃度：達到 106/毫升 4）合適的冷凍保護劑： DMSO,常用 10%。5）使用高濃度血清 第九十五 頁 ，共一百八十七 頁 。細胞 (x236。bāo)復蘇方法v 與快速融化的手段，以保證細胞外結晶在很短的時間(sh237。jiān)內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結晶對細胞造成損害 v 程序：（ l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37～ 38℃ 水浴中，使其融化（ 1分鐘左右）。（ 2） 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上。（ 3）低速離心 10分鐘。（ 4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。第九十六 頁 ，共一百八十七 頁 。第九十七 頁 ，共一百八十七 頁 。二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法 v 懸滴培養(yǎng)法 v 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 v 灌注 (gu224。nzh249。)小室培養(yǎng)法 v 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 v 培養(yǎng)板培養(yǎng)法v 克隆培養(yǎng)法第九十八 頁 ，共一百八十七 頁 。懸滴培養(yǎng)法 v 懸滴培養(yǎng)法：又稱植塊懸滴培養(yǎng)法， 1907年，哈里森首創(chuàng)。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后 (r225。nh242。u)翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。v 優(yōu)點： 1）容易換片。 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動位置，有利于組織分化。第九十九 頁 ，共一百八十七 頁 。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng) (p233。iyǎng)法 v 蓋爾（ Gey， 1933年）、劉易斯（ Lewis， 1934年）建立該方法。 v 特點：是培養(yǎng)中組織塊或細胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。包括旋轉(zhuǎn)管、旋轉(zhuǎn)鼓、支架等。 v 缺點：不易在顯微鏡下觀察。第一百 頁 ，共一百八十七 頁 。第一百零一 頁 ，共一百八十七 頁 。灌注小室培養(yǎng)(p233。iyǎng)法 v 在蓋玻片懸滴法基礎上發(fā)展而來，可用于連續(xù)觀察細胞動態(tài)變化，研究各種因素影響作用及活細胞反應。1912年由 Burrows首創(chuàng)。第一百零二 頁 ，共一百八十七 頁 。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 (fāngfǎ) v 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法：指將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。 v 1923年，卡雷爾（ Carrel）設計了卡氏瓶。 Earle設計了 T培養(yǎng)瓶。采用的材料對細胞無毒，透明。第一百零三 頁 ，共一百八十七 頁 。懸浮(xu225。nf)細胞培養(yǎng)瓶滾動 (gǔnd242。ng)培養(yǎng)瓶 第一百零四 頁 ，共一百八十七 頁 。? 蓋玻片 +培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：先以蓋玻片為生長表面，將擬培養(yǎng)細胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。v 優(yōu)點 (yōudiǎn)：1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存；3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。第一百零五 頁 ，共一百八十七 頁 。 培養(yǎng) (p233。iyǎng)板培養(yǎng) (p233。iyǎng)法 v 培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱微量培養(yǎng)法。 v 一般是一次性使用第一百零六 頁 ，共一百八十七 頁 。克隆 (k232。 l243。nɡ)培養(yǎng)法就是將細胞懸液中獲得的單個細胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個 (yī ɡ232。)新的細胞群體的培養(yǎng)技術 第一百零七 頁 ，共一百八十七 頁 。過程 (gu242。ch233。ng):制細胞 (x236。bāo)懸液 連續(xù)稀釋 (xīsh236。)獲得單細胞單細胞接種培養(yǎng)細胞株 :由細胞系進一步克隆化，而獲得的由單一細胞形成的細胞群體。 第一百零八 頁 ，共一百八十七 頁 。三 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術 (j236。sh249。) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術是建立在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)法基礎上，再融合固定化細胞、流式細胞術、填充床、生物反應器、人工灌流技術等發(fā)展起來的。（一）培養(yǎng)方法u 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)u 反應器貼壁培養(yǎng)u 懸浮培養(yǎng)技術 u 微載體培養(yǎng)技術 u 多孔載體培養(yǎng) u 微囊化培養(yǎng)技術 u 中空纖維法 固定化培養(yǎng)(p233。iyǎng)第一百零九 頁 ，共一百八十七 頁 。反應器貼壁培養(yǎng) v 此種培養(yǎng) (p233。iyǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng) (p233。iyǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng) (p233。iyǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)(p233。iyǎng)液的設備，可以采用灌流培養(yǎng) (p233。iyǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于 制備用量較小、價值高的生物藥品。 第一百一十 頁 ，共一百八十七 頁 。懸浮 (xu225。nf)培養(yǎng)技術適于少數(shù)懸浮生長 (shēngzhǎng)型細胞第一百一十一 頁 ，共一百八十七 頁 。微載體培養(yǎng)技術v 1967年， Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細胞，以直徑 60250um微珠作為微載體。v 原理：其原理是將對細胞無害的顆粒 微載體加入 (jiār249。)到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。 v 理想的細胞支持物特征 ：生物相容性；無毒害；好的傳質(zhì)特征；機械穩(wěn)定性好；比表面大，適于細胞生長；顆粒均一；能高壓滅菌；可重復利用，易清洗；接種方便；能固定大部分細胞，能保護細胞，易使細胞、載體和培養(yǎng)基分離；適合貼壁細胞和懸浮細胞培養(yǎng)。第一百一十二 頁 ，共一百八十七 頁 。微載體 (z224。itǐ)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞具體步驟 p110選擇合適的微載體 (z224。itǐ)類型浸泡 (j236。np224。o)水化及消毒接種培養(yǎng)觀察和細胞計數(shù)消化分離細胞傳代培養(yǎng)交聯(lián)葡萄糖DEAE纖維素蛋白質(zhì)：變性膠原高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯無機玻璃基質(zhì)常用商品化微載體有三種： Cytodex 3，Cytopore和 Cytoline。 第一百一十三 頁 ，共一百八十七 頁 。?多孔載體 (z224。itǐ)培養(yǎng)優(yōu)點：易固定化、比表面大、細胞在載體內(nèi)生長，免受機械損傷 (sǔnshāng)；可以提高通氣量，強化傳質(zhì)。適用于貼壁細胞培養(yǎng)、懸浮細胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。多孔載體材料 (c225。ili224。o)要求：生物相容性、機械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性第一百一十四 頁 ，共一百八十七 頁 。微囊化培養(yǎng)技術 v 人造的半透膜制成的多孔微球體，借鑒固定化技術將細胞包裹在微囊內(nèi)。適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。v 微囊直徑控制 (k242。ngzh236。)在 200400μm為宜。v 制備中應注意： v 溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作； v 所用試劑和膜材料對細胞無毒害； v 膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過； v 膜應有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。 第一百一十五 頁 ，共一百八十七 頁 。中空纖維法v Richard Kncazek 1972年發(fā)明。最初 (zu236。chū)使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結構。v 可以模擬細胞體內(nèi)三維狀態(tài)。v 目前材料有：硅膠、聚丙烯等。v 優(yōu)點是： 占地空間少； 細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達 109數(shù)量級； 生產(chǎn)成本低，且細胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細胞 第一百一十六 頁 ，共一百八十七 頁 。動物 (d242。ngw249。)細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物第一百一十七 頁 ，共一百