【正文】 種類(lèi)(zhǒngl232。i)：,Production of anthocyanin,第八十九頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,加入(jiār249。)培養(yǎng)基,排出(p225。i chū)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物,連續(xù)培養(yǎng)圖示：,第九十頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,條件培養(yǎng)基 細(xì)胞(x236。bāo)密度(臨界密度) 生長(zhǎng)激素 pH CO2,3. 影響(yǐngxiǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)的因子,第九十一頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,4. 細(xì)胞的保存(bǎocn) （1）繼代培養(yǎng)保存法 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞每隔12周換液進(jìn)行繼代培養(yǎng)。如高等植物細(xì)胞、海藻等的細(xì)胞。 （2）低溫保存法 一般選擇510℃ 的溫度下培養(yǎng)，每隔10天換液。 （3）冰凍保存法 1）低溫保存 20℃ 左右保存細(xì)胞。 2）超低溫保存 液氮保存。溫度達(dá)到196℃ 。效果最理想。,第九十二頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.4.5 植物(zh237。w249。)細(xì)胞培養(yǎng)的意義,目前利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物產(chǎn)品已成為工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的一條有效途徑。 隨著植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞培養(yǎng)的成功，加之各種新型生物反應(yīng)器的問(wèn)世，使得植物細(xì)胞有可能象微生物那樣在發(fā)酵罐中大量連續(xù)培養(yǎng)。因此在人為條件下大規(guī)模培養(yǎng)這些植物細(xì)胞具有極大(j237。 d224。)的經(jīng)濟(jì)吸引力。,第九十三頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,與整株植物栽培相比，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括： （1）代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)是在控制條件下進(jìn)行的，因此可以通過(guò)選擇優(yōu)良細(xì)胞系和優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法(fāngfǎ)得到超越整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物。不僅節(jié)約能源，減少耕地占用面積，而且不受季節(jié)、地域的限制。 （2）細(xì)胞培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，因此可以排出病菌和害蟲(chóng)的影響。 （3）可以通過(guò)特定的生物轉(zhuǎn)化途徑獲得均一的有效成分。 （4）可以探索新的合成路線，獲得新的有用物質(zhì)。,第九十四頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,總之，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行有用物質(zhì)生產(chǎn)不受時(shí)間、環(huán)境等條件限制，而且快速、高效。植物細(xì)胞培養(yǎng)用于具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方面現(xiàn)已成為繼微生物發(fā)酵技術(shù)以后當(dāng)代(dāngd224。i)生物技術(shù)的一個(gè)重要應(yīng)用技術(shù)。,第九十五頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,思考題,1. 如何制作人工種子？制作過(guò)程中要注意哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？ 2. 與天然種子相比，人工種子有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？ 3. 植物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分主要包括哪些？分別起什么作用？ 4. 植物單細(xì)胞培養(yǎng)有哪些方法？指出每一種(yī zhǒnɡ)培養(yǎng)方法的要點(diǎn)。,第九十六頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.5 植物(zh237。w249。)原生質(zhì)體培養(yǎng),3.5.1 原生質(zhì)體 3.5.2 原生質(zhì)體的制備(zh236。b232。i) 3.5.3 原生質(zhì)體培養(yǎng) 3.5.4 原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生 3.5.5 應(yīng)用舉例,第九十七頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.5.1 原生質(zhì)體,1. 定義 植物原生質(zhì)體（protoplast)是指將植物細(xì)胞壁除去后得到裸露的球形細(xì)胞。通常通過(guò)混合酶液的消化細(xì)胞壁而獲得，原生質(zhì)體經(jīng)適宜的培養(yǎng)(p233。iyǎng)能合成新壁，并進(jìn)行細(xì)胞分裂，從而生成完整植株。,植物(zh237。w249。)細(xì)胞形態(tài),植物(zh237。w249。)細(xì)胞質(zhì)壁分離,第九十八頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,2. 原生質(zhì)體的特點(diǎn)(t232。diǎn),（1）無(wú)細(xì)胞壁障礙，可方便地進(jìn)行有關(guān)遺傳操作，并可以對(duì)膜、細(xì)胞器等進(jìn)行基礎(chǔ)研究。 （2）具有全能性，并能進(jìn)行人工培養(yǎng)發(fā)育成完整(w225。nzhěng)植株。 （3）原生質(zhì)體適合進(jìn)行誘導(dǎo)融合形成雜種細(xì)胞。,第九十九頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3. 原生質(zhì)體的用途(y242。ngt),（1）提供相關(guān)生理生化研究（如細(xì)胞壁的生物合成、質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)與功能、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間相互關(guān)系與激素作用等）的材料。 （2）利用原生質(zhì)體可攝取如病毒、細(xì)菌、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、核酸等外源物質(zhì)的特點(diǎn)而被用作研究基因調(diào)控和表達(dá)、遺傳工程研究的材料。 （3）進(jìn)行原生質(zhì)體融合，改變遺傳物質(zhì)，建立雜交品種；同時(shí)用于研究染色體行為、基因定位等。 （4）用于細(xì)胞器的分離，或進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞器的遺傳(y237。chu225。n)實(shí)驗(yàn)。,第一百頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.5.2 原生質(zhì)體的制備(zh236。b232。i),原生質(zhì)體的來(lái)源 原生質(zhì)體的分離 原生質(zhì)體純化(chn hu224。) 原生質(zhì)體鑒定與活力測(cè)定,第一百零一頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,原生質(zhì)體的來(lái)源： 從理論上講，植物體的任何(r232。nh233。)一部分都可以通過(guò)酶解作用去除細(xì)胞壁而得到原生質(zhì)體。但在實(shí)際操作中，只有幼嫩的組織才能完成去壁的過(guò)程。所以，為了制備健康的原生質(zhì)體，一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的愈傷組織為材料，還有植物花粉，用于制備單倍體的原生質(zhì)體以及體細(xì)胞胚及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中獲得，一旦細(xì)胞具有木質(zhì)化或次生加厚的外壁，則不能被酶降解。因此，取材成為實(shí)驗(yàn)成功與否的首要問(wèn)題。,第一百零二頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,原生質(zhì)體的分離： （1）機(jī)械法 1892年，Klercker采用機(jī)械法剝離原生質(zhì)體，但該法手工操作難度大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，得率很低。 （2）酶解法 該法具有條件溫和，原生質(zhì)體完整性好，活力高、得率高等優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)。 常有的酶有：瓊脂酶、果膠酶、蝸牛酶、纖維素酶等。,第一百零三頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,原生質(zhì)體純化(chn hu224。)： 過(guò)濾離心法 漂浮法 沉降法和漂浮法結(jié)合,第一百零四頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,原生質(zhì)體鑒定與活力(hu243。l236。)測(cè)定,原生質(zhì)體鑒定(ji224。nd236。ng) 經(jīng)分離、純化后的原生質(zhì)體需要進(jìn)行鑒定，以檢驗(yàn)所獲得的原生質(zhì)體是否是真正的原生質(zhì)體。其方法有： （1）低滲爆破法 （2）熒光染色法 2. 原生質(zhì)體活力測(cè)定 （1）染色法 （2）胞質(zhì)環(huán)流法 （3）滲透壓變化 （4）氧電極法,第一百零五頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.5.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)(p233。iyǎng),用于原生質(zhì)體培養(yǎng)(p233。iyǎng)的方法有： 液體培養(yǎng)法 固體平板法 雙層培養(yǎng)法,3.5.4 原生質(zhì)體的發(fā)育(fāy249。)和植株再生,細(xì)胞壁再生 分裂 愈傷組織或胚狀體的形成 植株再生,第一百零六頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.5.5 原生質(zhì)體培養(yǎng)(p233。iyǎng)再生植株的應(yīng)用舉例,以多年生大花萱草為例，學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)。 1.取盛開(kāi)的大花萱草作為實(shí)驗(yàn)材料，我們可以(kěyǐ)看到在每一個(gè)花瓣上都具有紅、黃、白三種顏色。,盛開(kāi)(sh232。ngkāi)的大花萱草,第一百零七頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,2.花瓣(huāb224。n)表皮為排列緊密的表皮組織，不易酶解，用尖頭鑷子撕去表皮。將暴露的花肉組織浸泡在酶液里。排列相對(duì)疏松的花肉細(xì)胞很容易被酶液消化。,第一百零八頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,3.將暴露的花肉組織浸泡在酶液里。在酶液消化過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)材料(c225。ili224。o)的個(gè)體差異，酶解時(shí)間不固定。因此要用顯微鏡隨時(shí)檢查酶解情況。,第一百零九頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,4.酶解好的原生質(zhì)體經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾到離心管中，除去未消化的大塊(d224。 ku224。i)組織。離心5分鐘（5001000轉(zhuǎn)/分）使懸浮的原生質(zhì)體下降至離心管底部，緩緩傾倒出上清液，加入培養(yǎng)液，吹打使其懸浮，再離心，重復(fù)2次，目的是洗去酶液，使原生質(zhì)體懸浮在等滲培養(yǎng)基中。,第一百一十頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,5.顯微鏡檢查清洗后的原生質(zhì)體，如碎片過(guò)多，則用蔗糖漂浮法去除(q249。 ch)碎片。蔗糖漂浮法：細(xì)口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生質(zhì)體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質(zhì)體懸液中間有一明顯界面. 離心5分鐘（500轉(zhuǎn)/分），此時(shí)死細(xì)胞及碎片降至蔗糖溶液內(nèi)，聚集在離心管底部，而活細(xì)胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處，用細(xì)管輕輕插入底部將沉降在離心管底部的碎片小心吹打，混勻在蔗糖溶液中，連同蔗糖溶液一起小心吸出， 再吸去上清液即得到健康的原生質(zhì)體。,第一百一十一頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,6. 接種原生質(zhì)體于合適的培養(yǎng)(p233。iyǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(p233。iyǎng)。當(dāng)原生質(zhì)體發(fā)育成的愈傷組織分化出球芽后，將其移植進(jìn)培養(yǎng)(p233。iyǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)(p233。iyǎng)，誘導(dǎo)分化出苗，繼而發(fā)育成完整植株。,第一百一十二頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,思考題,重點(diǎn)將教材(ji224。oc225。i)第3章后的課后題進(jìn)行思考練習(xí)。,第一百一十三頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),第3章 植物組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)。無(wú)性繁殖系(clone)：由同一個(gè)外植體反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)后所得一系列的無(wú)性繁殖后代。（1）在一個(gè)培養(yǎng)物上所能產(chǎn)生的胚狀體數(shù)目往往(wǎngwǎng)比不定芽數(shù)目多。增殖1個(gè)月左右后，可視情況進(jìn)行再增殖。三是蛋白質(zhì)合成加快，分裂前細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的總量增加200%。一體化設(shè)計(jì)的霧化生物反應(yīng)器（培養(yǎng)青篙毛狀根生產(chǎn)青篙素）。細(xì)胞密度(臨界密度)。一般選擇510℃ 的溫度下培養(yǎng)，每隔10天換液,第一百一十四頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,