【正文】 種類(zhǒngl232。i)：,Production of anthocyanin,第八十九頁，共一百一十四頁。,加入(jiār249。)培養(yǎng)基,排出(p225。i chū)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物,連續(xù)培養(yǎng)圖示：,第九十頁，共一百一十四頁。,條件培養(yǎng)基 細胞(x236。bāo)密度(臨界密度) 生長激素 pH CO2,3. 影響(yǐngxiǎng)單細胞培養(yǎng)的因子,第九十一頁，共一百一十四頁。,4. 細胞的保存(bǎocn) （1）繼代培養(yǎng)保存法 懸浮培養(yǎng)的細胞每隔12周換液進行繼代培養(yǎng)。如高等植物細胞、海藻等的細胞。 （2）低溫保存法 一般選擇510℃ 的溫度下培養(yǎng)，每隔10天換液。 （3）冰凍保存法 1）低溫保存 20℃ 左右保存細胞。 2）超低溫保存 液氮保存。溫度達到196℃ 。效果最理想。,第九十二頁，共一百一十四頁。,3.4.5 植物(zh237。w249。)細胞培養(yǎng)的意義,目前利用植物細胞培養(yǎng)技術生產植物產品已成為工業(yè)化生產植物產品的一條有效途徑。 隨著植物細胞懸浮培養(yǎng)技術的發(fā)展，單細胞培養(yǎng)的成功，加之各種新型生物反應器的問世，使得植物細胞有可能象微生物那樣在發(fā)酵罐中大量連續(xù)培養(yǎng)。因此在人為條件下大規(guī)模培養(yǎng)這些植物細胞具有極大(j237。 d224。)的經濟吸引力。,第九十三頁，共一百一十四頁。,與整株植物栽培相比，細胞培養(yǎng)技術的優(yōu)點包括： （1）代謝產物的生產是在控制條件下進行的，因此可以通過選擇優(yōu)良細胞系和優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法(fāngfǎ)得到超越整株植物產量的代謝產物。不僅節(jié)約能源，減少耕地占用面積，而且不受季節(jié)、地域的限制。 （2）細胞培養(yǎng)是在無菌條件下進行的，因此可以排出病菌和害蟲的影響。 （3）可以通過特定的生物轉化途徑獲得均一的有效成分。 （4）可以探索新的合成路線，獲得新的有用物質。,第九十四頁，共一百一十四頁。,總之，利用植物細胞培養(yǎng)進行有用物質生產不受時間、環(huán)境等條件限制，而且快速、高效。植物細胞培養(yǎng)用于具有生理活性的次生代謝產物的生產方面現已成為繼微生物發(fā)酵技術以后當代(dāngd224。i)生物技術的一個重要應用技術。,第九十五頁，共一百一十四頁。,思考題,1. 如何制作人工種子？制作過程中要注意哪些關鍵環(huán)節(jié)？ 2. 與天然種子相比，人工種子有哪些優(yōu)缺點？ 3. 植物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)成分主要包括哪些？分別起什么作用？ 4. 植物單細胞培養(yǎng)有哪些方法？指出每一種(yī zhǒnɡ)培養(yǎng)方法的要點。,第九十六頁，共一百一十四頁。,3.5 植物(zh237。w249。)原生質體培養(yǎng),3.5.1 原生質體 3.5.2 原生質體的制備(zh236。b232。i) 3.5.3 原生質體培養(yǎng) 3.5.4 原生質體的發(fā)育和植株再生 3.5.5 應用舉例,第九十七頁，共一百一十四頁。,3.5.1 原生質體,1. 定義 植物原生質體（protoplast)是指將植物細胞壁除去后得到裸露的球形細胞。通常通過混合酶液的消化細胞壁而獲得，原生質體經適宜的培養(yǎng)(p233。iyǎng)能合成新壁，并進行細胞分裂，從而生成完整植株。,植物(zh237。w249。)細胞形態(tài),植物(zh237。w249。)細胞質壁分離,第九十八頁，共一百一十四頁。,2. 原生質體的特點(t232。diǎn),（1）無細胞壁障礙，可方便地進行有關遺傳操作，并可以對膜、細胞器等進行基礎研究。 （2）具有全能性，并能進行人工培養(yǎng)發(fā)育成完整(w225。nzhěng)植株。 （3）原生質體適合進行誘導融合形成雜種細胞。,第九十九頁，共一百一十四頁。,3. 原生質體的用途(y242。ngt),（1）提供相關生理生化研究（如細胞壁的生物合成、質膜的結構與功能、物質運輸、能量轉換、信息傳遞、細胞識別、細胞間相互關系與激素作用等）的材料。 （2）利用原生質體可攝取如病毒、細菌、細胞器、蛋白質、核酸等外源物質的特點而被用作研究基因調控和表達、遺傳工程研究的材料。 （3）進行原生質體融合，改變遺傳物質，建立雜交品種；同時用于研究染色體行為、基因定位等。 （4）用于細胞器的分離，或進行相關細胞器的遺傳(y237。chu225。n)實驗。,第一百頁，共一百一十四頁。,3.5.2 原生質體的制備(zh236。b232。i),原生質體的來源 原生質體的分離 原生質體純化(chn hu224。) 原生質體鑒定與活力測定,第一百零一頁，共一百一十四頁。,原生質體的來源： 從理論上講，植物體的任何(r232。nh233。)一部分都可以通過酶解作用去除細胞壁而得到原生質體。但在實際操作中，只有幼嫩的組織才能完成去壁的過程。所以，為了制備健康的原生質體，一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對數生長期的愈傷組織為材料，還有植物花粉，用于制備單倍體的原生質體以及體細胞胚及懸浮培養(yǎng)細胞中獲得，一旦細胞具有木質化或次生加厚的外壁，則不能被酶降解。因此，取材成為實驗成功與否的首要問題。,第一百零二頁，共一百一十四頁。,原生質體的分離： （1）機械法 1892年，Klercker采用機械法剝離原生質體，但該法手工操作難度大，費時費力，得率很低。 （2）酶解法 該法具有條件溫和，原生質體完整性好，活力高、得率高等優(yōu)點(yōudiǎn)。 常有的酶有：瓊脂酶、果膠酶、蝸牛酶、纖維素酶等。,第一百零三頁，共一百一十四頁。,原生質體純化(chn hu224。)： 過濾離心法 漂浮法 沉降法和漂浮法結合,第一百零四頁，共一百一十四頁。,原生質體鑒定與活力(hu243。l236。)測定,原生質體鑒定(ji224。nd236。ng) 經分離、純化后的原生質體需要進行鑒定，以檢驗所獲得的原生質體是否是真正的原生質體。其方法有： （1）低滲爆破法 （2）熒光染色法 2. 原生質體活力測定 （1）染色法 （2）胞質環(huán)流法 （3）滲透壓變化 （4）氧電極法,第一百零五頁，共一百一十四頁。,3.5.3 原生質體培養(yǎng)(p233。iyǎng),用于原生質體培養(yǎng)(p233。iyǎng)的方法有： 液體培養(yǎng)法 固體平板法 雙層培養(yǎng)法,3.5.4 原生質體的發(fā)育(fāy249。)和植株再生,細胞壁再生 分裂 愈傷組織或胚狀體的形成 植株再生,第一百零六頁，共一百一十四頁。,3.5.5 原生質體培養(yǎng)(p233。iyǎng)再生植株的應用舉例,以多年生大花萱草為例，學習植物原生質體的培養(yǎng)技術。 1.取盛開的大花萱草作為實驗材料，我們可以(kěyǐ)看到在每一個花瓣上都具有紅、黃、白三種顏色。,盛開(sh232。ngkāi)的大花萱草,第一百零七頁，共一百一十四頁。,2.花瓣(huāb224。n)表皮為排列緊密的表皮組織，不易酶解，用尖頭鑷子撕去表皮。將暴露的花肉組織浸泡在酶液里。排列相對疏松的花肉細胞很容易被酶液消化。,第一百零八頁，共一百一十四頁。,3.將暴露的花肉組織浸泡在酶液里。在酶液消化過程中，由于實驗材料(c225。ili224。o)的個體差異，酶解時間不固定。因此要用顯微鏡隨時檢查酶解情況。,第一百零九頁，共一百一十四頁。,4.酶解好的原生質體經300目尼龍網過濾到離心管中，除去未消化的大塊(d224。 ku224。i)組織。離心5分鐘（5001000轉/分）使懸浮的原生質體下降至離心管底部，緩緩傾倒出上清液，加入培養(yǎng)液，吹打使其懸浮，再離心，重復2次，目的是洗去酶液，使原生質體懸浮在等滲培養(yǎng)基中。,第一百一十頁，共一百一十四頁。,5.顯微鏡檢查清洗后的原生質體，如碎片過多，則用蔗糖漂浮法去除(q249。 ch)碎片。蔗糖漂浮法：細口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生質體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質體懸液中間有一明顯界面. 離心5分鐘（500轉/分），此時死細胞及碎片降至蔗糖溶液內，聚集在離心管底部，而活細胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處，用細管輕輕插入底部將沉降在離心管底部的碎片小心吹打，混勻在蔗糖溶液中，連同蔗糖溶液一起小心吸出， 再吸去上清液即得到健康的原生質體。,第一百一十一頁，共一百一十四頁。,6. 接種原生質體于合適的培養(yǎng)(p233。iyǎng)基上進行培養(yǎng)(p233。iyǎng)。當原生質體發(fā)育成的愈傷組織分化出球芽后，將其移植進培養(yǎng)(p233。iyǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)(p233。iyǎng)，誘導分化出苗，繼而發(fā)育成完整植株。,第一百一十二頁，共一百一十四頁。,思考題,重點將教材(ji224。oc225。i)第3章后的課后題進行思考練習。,第一百一十三頁，共一百一十四頁。,內容(n232。ir243。ng)總結,第3章 植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)。無性繁殖系(clone)：由同一個外植體反復進行繼代培養(yǎng)后所得一系列的無性繁殖后代。（1）在一個培養(yǎng)物上所能產生的胚狀體數目往往(wǎngwǎng)比不定芽數目多。增殖1個月左右后，可視情況進行再增殖。三是蛋白質合成加快，分裂前細胞內蛋白質的總量增加200%。一體化設計的霧化生物反應器（培養(yǎng)青篙毛狀根生產青篙素）。細胞密度(臨界密度)。一般選擇510℃ 的溫度下培養(yǎng)，每隔10天換液,第一百一十四頁，共一百一十四頁。,