20xx年醫(yī)學(xué)專(zhuān)題—培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇(參考版)
2024-11-19 04:37本頁(yè)面
【正文】 稀釋過(guò)程也要緩慢進(jìn)行，保證有足夠的時(shí)間讓冷凍保護(hù)劑從細(xì)胞內(nèi)滲出，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。 結(jié)果 復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。全過(guò)程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行； (4) 將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。一次可以進(jìn)行多個(gè)凍存管的復(fù)蘇；(2) 將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中； (3) 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。 操作過(guò)程 (1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。 （二）玻璃化凍存的復(fù)蘇方法 以下以人的單核細(xì)胞為例說(shuō)明其過(guò)程（Takhashi et al. 1986）。 討論 細(xì)胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。 復(fù)蘇過(guò)程 （1） 調(diào)配37℃～40℃的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至37℃～40℃； （2） 從液氮中取出凍存管，立即投入37℃～40℃ 溫水中迅速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解； （3） 將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻； （4） 將細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min，棄上清夜； （5） 向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過(guò)快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時(shí)間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡。 因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對(duì)細(xì)胞具有毒性（但在4℃時(shí)毒性大為減弱）。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。凍存結(jié)果 如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。； （7）將凍存管兩端以火焰封口； （8）最后將凍存管直接投入液氮中保存。滴加的時(shí)間在15min左右。滴加過(guò)程為：。 （2）凍存管：SILASTIC玻璃小管，內(nèi)徑3mm，； （3）設(shè)備：液氮儲(chǔ)存罐； （4）待凍存細(xì)胞：人類(lèi)外周血單核細(xì)胞。 主要材料 （1）冷凍保護(hù)液：%DMSO（w/v）、%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí)，需要從196℃的液氮中取出凍存管，立即投入37～40℃溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn)。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，要復(fù)蘇1～2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。 應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。若液氮濺出，可能對(duì)皮膚造成凍傷。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)最好帶手套。 討論 在使用DMSO前，不要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過(guò)程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。 (1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），約40min； (2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（10℃～20℃），約30～60min； (3)將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（30℃），放置30min左右； (4)然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（70℃～80℃），過(guò)夜； (5)最后將凍存管投入液氮保存。使用前，于室溫
畢業(yè)設(shè)計(jì)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1