【正文】 如可導(dǎo),第一百一十二頁，共一百一十二頁。活因子（MAN）、T細(xì)胞替代因子(TRF)等。tǒng)，細(xì)胞接種于空心纖。在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，融合固定化。ng)總結(jié),第四章 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture)。,內(nèi)容(n232。如可導(dǎo) 電聚合物、膀胱、（人眼角膜細(xì)胞培育）人造角膜。)巨大反響。 我國該領(lǐng)域的工作，取得了極有價值成果，我國曹 誼林教授在裸鼠背上復(fù)制人耳，引起國際(gu243。美 國密執(zhí)安大學(xué)開發(fā)生物工程人造腎。,4.4.6 最新進(jìn)展,名副其實(shí)的備用人體器官將在數(shù)年內(nèi)由實(shí)驗(yàn)室走向 患者。s224。,第一百零九頁，共一百一十二頁。 5）9~10個微擴(kuò)散裝置放入密閉小室內(nèi)，沖入95%的O2和 5%的CO2的混合氣體，37度培養(yǎng)。 3）給Conway微擴(kuò)散單位裝置中央孔內(nèi)加滿培養(yǎng)液，消 毒濾紙蓋住中央孔。 1）拉頸處死13日齡大鼠，消毒，取出肝臟，置于含培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿中。,4.4.5.4 肝臟的培養(yǎng)： 體外培養(yǎng)肝臟在研究肝臟生理病理過程及其機(jī)制方面有重大 意義。 3）放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。 1）——乙醚麻醉大鼠，消毒開胸，剪取胸動脈，培 養(yǎng)液沖洗血管內(nèi)壁，剪成3.5mm左右的動脈管。懸浮孵育法 培養(yǎng)具體操作如下： 培養(yǎng)基：血漿、199和DEM培養(yǎng)基。yǒu)重要意義。,第一百零七頁，共一百一十二頁。 3.培養(yǎng)盤或板先加0.5ml培養(yǎng)液，植入植塊，再加 1ml 培養(yǎng)液，加蓋，37度、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。 2. 剪開鼠胎的顱蓋骨，取出腦組織置PBS的培養(yǎng)皿 中，獲得腦葉。 培養(yǎng)基：DMEM，加小牛血清，青、鏈霉素。,4.4.5.2 神經(jīng)組織的器官培養(yǎng) 1985年，斯坦斯維格成功建立了大鼠胚胎腦組織的 培養(yǎng)——半固體瓊脂包埋靜止(j236。結(jié)果：股骨增長增粗，軟骨 細(xì)胞肥大。 4. 將股骨植塊植于培養(yǎng)管的血漿上，每隔約15分 鐘可放入一個股骨，加塞，室溫靜止1~2小時。ngd249。 2. 用小鑷子在骶關(guān)節(jié)處解離雞胚下肢。,第一百零五頁，共一百一十二頁。軟骨培養(yǎng)可采用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、 血漿凝塊培養(yǎng)法和金屬格柵培養(yǎng)法。iyǎng)： 軟骨培養(yǎng)常用于研究軟骨與骨的生長分化及影響因 素。,4.4.5 器官培養(yǎng)(p233。guān)培養(yǎng)裝置圖,1.進(jìn)氣口 2.空氣過濾器 3.乳膠管 4.針頭 5.膠塞 6.儲液瓶 7.培養(yǎng)液 8.注射器外套 9.器官植塊 10.瓊脂 11.輸液管 12.膨大部 13.恒流泵 14.樣品(y224。,第一百零三頁，共一百一十二頁。陳細(xì)華等采用長時間灌流式器官培養(yǎng)方法進(jìn)行 了草魚腦垂體的完整器官長期培養(yǎng)，82天內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)(fāxi224。他們用泵將營養(yǎng) 液泵入器官內(nèi)，并經(jīng)過器官循環(huán)后流出，這是最早的 灌注式培養(yǎng)器官的嘗試。,第一百零二頁，共一百一十二頁。樣 品從樣品收集口收集。)。guān)培養(yǎng)—灌流式器官培養(yǎng)法,培養(yǎng)系統(tǒng)的特征： 采用一個連有傾斜注射器外套的培養(yǎng)容器，新鮮 培養(yǎng)液從儲液罐通過注射器不斷流入培養(yǎng)容器，液體 由外套的出口端流出，其流速由恒流泵控制(k242。,第一百零一頁，共一百一十二頁。 1976年（Barret等）創(chuàng)立搖擺式器官培養(yǎng)法：采 用平臺式搖擺儀使培養(yǎng)的器官植塊交替(jiāot236。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官(q236。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)期間，植塊斷續(xù)地與培養(yǎng)液和氣相接觸， 可獲得充足的營養(yǎng)和氧氣。d236。ntǒng)的器官培養(yǎng)方法,旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 最早于1933年（Gey）建立。,第九十九頁，共一百一十二頁。ich237。瓊脂起支持和防止培養(yǎng) 器官的細(xì)胞發(fā)生遷移的作用。,4.4.3 傳統(tǒng)(chu225。ngwěn)、安全，支托或移動大量 的培養(yǎng)器官。 最初為高耗氧的成體器官培養(yǎng)而設(shè)計。guān)培養(yǎng)方法,金屬格柵器官培養(yǎng)法： 漂浮支持物很難持久地漂浮。,第九十七頁，共一百一十二頁。n)進(jìn)行器官培養(yǎng)的方法。iyǎng)方法,擦鏡紙培養(yǎng)法： 直接漂浮培養(yǎng)法的不足：器官易轉(zhuǎn)曲。,第九十六頁，共一百一十二頁。 此法適合于高耗氧的成體器官的培養(yǎng)。jiē)漂浮培養(yǎng)法： 器官浸入培養(yǎng)液中，不能持續(xù)接觸空氣（O2）易 于缺氧壞死。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)(p233。ngjiě)在培養(yǎng)液中，并防止植 快下沉而黏附。guān)培養(yǎng)方法,懸浮培養(yǎng)法： 是最簡便最早使用的液體培養(yǎng)法，可隨時加影響因 子或生化分析（瓊脂凝膠培養(yǎng)法只有在轉(zhuǎn)培養(yǎng)時才能 進(jìn)行）。,第九十四頁，共一百一十二頁。)受到抑制。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)(p233。 已成功用于研究胚胎原基的形態(tài)發(fā)生，改良后可用 于激素、維生素、致癌因子對哺乳動物成年器官的作 用等方面的研究。)。guān)培養(yǎng)方法,表玻璃器官培養(yǎng)法： Ｆell 和 Robinson（1929）建立(ji224。,第九十二頁，共一百一十二頁。 （２）只能成功培養(yǎng)幾周，且僅能維持其存活和保 持其結(jié)構(gòu)功能（因其高耗氧率和細(xì)胞的高度分化）。iyǎng)的特點(diǎn),成體器官(q236。,第九十一頁，共一百一十二頁。 （2）早期胚胎器官（原基）體積較小，可將整個 器官進(jìn)行培養(yǎng)。nɡ tǐ)器官培養(yǎng)的特點(diǎn),基本原則： （1）提供充足的營養(yǎng)和O2，及時排除代謝廢物； （2）抑制細(xì)胞從植快向外遷移。,第九十頁，共一百一十二頁。 （3）器官培養(yǎng)無器官數(shù)量的增加。)，一片皮膚等。 （2）被培養(yǎng)物是完整器官或具有完整功能的某一 器官的一部分。iyǎng)概述,器官培養(yǎng)的特征： 器官培養(yǎng)與器官保存、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)不同： （1）被培養(yǎng)器官存活較長時間，保持相對正常功 能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常功能甚至增殖。,第八十九頁，共一百一十二頁。 現(xiàn)代器官培養(yǎng)的共同點(diǎn)： （1）培養(yǎng)對象：非胚胎和胚胎器官的一部分； （2）浸泡在培養(yǎng)液中培養(yǎng)； （3）被培養(yǎng)組織器官的細(xì)胞以簡單擴(kuò)散方式獲得氧 氣和其他(q237。,4.4 .1 器官(q236。 發(fā)展歷史：最早Leob（1897年）進(jìn)行成年兔一些器官的 嘗試性培養(yǎng)——血漿凝快培養(yǎng)兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等 （3天）；20世紀(jì)初器官培養(yǎng)進(jìn)入活躍時期（主要限于胚胎器 官）；20世紀(jì)50年代進(jìn)入蓬勃發(fā)展階段（不限于胚胎器官）， 技術(shù)、器皿、培養(yǎng)基等有了許多改良和革新。iyǎng)：主要采用類似于組織培養(yǎng)中植塊培養(yǎng)的方式 培養(yǎng)器官型植塊。,4.4 器官(q236。 硼酸鹽緩沖液配制的多聚賴氨酸生長基質(zhì)，其效果好于 蒸餾水。 因材料來源于胚胎組織，所以培養(yǎng)物中還有少量(shǎoli224。,4.3.2.3 神經(jīng)(sh233。njīng)組織的體外培養(yǎng),培養(yǎng)步驟： （1）取大鼠胸、腰段脊髓(jǐ suǐ)，剔除脊膜，顯微鏡下分離暗灰色 組織，剪碎； （2）37℃ 0.25%胰蛋白酶消化15 min，胎牛血清終止酶活性 后，離心、懸浮、吹打，再離心，制得細(xì)胞懸浮液； （3）10ml 細(xì)胞懸液于直徑100mm培養(yǎng)皿中， 37℃、5%的 CO2 孵育2~3h，利于最大限度貼壁； （4）未貼壁的細(xì)胞離心，重新獲得細(xì)胞懸浮液，記數(shù)； （5）用多聚賴氨酸液預(yù)先包被培養(yǎng)皿（ 37℃ ）24h，每皿 接種106個懸浮細(xì)胞； （6）CO2 培養(yǎng)箱孵育2h，換無血清化學(xué)限制培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)，4天后換液。,第八十五頁，共一百一十二頁。 差速處理富集脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)法： 材料： 動物：胚齡14天的大鼠胚胎； 培養(yǎng)液：（1）含血清的培養(yǎng)液：DMEM加20%胎 牛血清、50 IU∕ml的青霉素、50μg ∕ml 的鏈霉素 （2）無血清的培養(yǎng)液：DMEM 加5μg ∕ml 牛胰島 素、50 μg ∕ml 人轉(zhuǎn)鐵蛋白。oji224。即體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。（不同組織來源的細(xì)胞連續(xù)傳 代會導(dǎo)致生長增殖活動停止，也有肌源性表型喪失的趨勢）,第八十四頁，共一百一十二頁。,骨骼肌培養(yǎng)的結(jié)果： 接種數(shù)小時后多數(shù)細(xì)胞貼壁，主要為單核（外觀明顯）細(xì) 胞；前2天是細(xì)胞增殖的主要時期，無明顯細(xì)胞融合；50~52 h 后，細(xì)胞進(jìn)入快速融和期；多核細(xì)胞快速生長導(dǎo)致纖維網(wǎng)的形 成；數(shù)天后融合結(jié)束，之后可觀察到纖維的自發(fā)收縮現(xiàn)象；再 過1~2天，骨骼肌細(xì)胞的特征橫紋開始(kāishǐ)變得明顯；有時肉眼可 見到細(xì)胞收縮；適當(dāng)條件下，細(xì)胞增殖一代時間為11~13 h。（3）取原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞記數(shù)，接種在明 膠覆蓋的培養(yǎng)板上，進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)。 培養(yǎng)過程：（1）處死動物，分離大腿肌肉，洗滌，胰蛋 白酶消化，收集懸浮細(xì)胞。,第八十二頁，共一百一十二頁。肌肉受傷后，肌衛(wèi)細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)化 為肌細(xì)胞，進(jìn)一步分化為肌纖維，填補(bǔ)受傷部位。緊貼骨骼肌細(xì)胞表面，扁平，有突起 能進(jìn)行有絲分裂(yǒu sī fēn li232。,第八十一頁，共一百一十二頁。bāo)富含肌原纖維具收縮能力，故培 養(yǎng)方法上有其特殊性。 肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細(xì)胞在離體環(huán)境中 存活、生長或發(fā)育。u zǔ zhī)的體外培養(yǎng),4.3.2.2.1 肌肉組織的特點(diǎn)： 又稱肌組織，來自于中胚層具收縮能力的肌細(xì)胞。,第八十頁，共一百一十二頁。ngh233。,第七十九頁，共一百一十二頁。i)：3T3細(xì)胞覆蓋瓶底一半時→換培養(yǎng) 液→培養(yǎng)24h →接近融合→加1~10 μg ∕ml絲裂霉素C，培養(yǎng) 12h →培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次→胰蛋白酶消化→種植在培養(yǎng)瓶中 →加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液→37℃培養(yǎng)→貼壁后12h（再種植角 質(zhì)形成細(xì)胞）。 （2）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備(zh236。,第七十八頁，共一百一十二頁。 3T3細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM加10%胎牛血清、4 mmol∕L谷 氨酰胺、青霉素100 IU∕ml、鏈霉素100 μg ∕ml。 hǎo)，燒傷的依情況定。ngp237。,第七十七頁，共一百一十二頁。j236。zǔzhī)的體外培養(yǎng),二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 表皮細(xì)胞：角質(zhì)形成細(xì)胞（角蛋白細(xì)胞，占絕大 多數(shù)）和非角質(zhì)形成細(xì)胞（數(shù)量不多，更新慢）。,4.3.2.1 上皮組織(sh224。 （2）接觸抑制：培養(yǎng)一段時間后，細(xì)胞增多成片 后，運(yùn)動和生長受到抑制。ngp237。ngp237。)組織的體外培養(yǎng) 4.3.2.2 肌肉組織的體外培養(yǎng) 1.肌肉組織的特點(diǎn) 2.骨骼肌的培養(yǎng) 4.3.2.3 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng),第七十五頁，共一百一十二頁。,第七十四頁，共一百一十二頁。 正在實(shí)驗(yàn)室里生長(shēngzhǎng)成形的：肝臟、胰臟、心臟 乳房、手指、耳朵等。,第七十三頁，共一百一十二頁。o)制成的各鐘三維結(jié) 構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體（支架），在細(xì)胞增殖過程中，提 供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而 自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定 形態(tài)和功能的組織和器官。)缺損器官,采用相容性好的生物可降解材料(c225。,第七十二頁，共一百一十二頁。)反應(yīng)，失敗率極高；異體 器官來源有限，供不應(yīng)求，難以實(shí)施移植。 異體移植：最難解決免疫排斥(p225。,4.3.1.2 修復(fù)缺損器官(q236。bāo)種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)、繁殖、擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。,4.3 組織(zǔzhī)工程,4.3.1 概述 4.3.1.1 組織工程： 組織工程：應(yīng)用細(xì)胞(x236。 5.相關(guān)基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研究。ng)廉價的微載體。 2.開發(fā)高密度生長、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。nzhu224。,第六十九