生化實(shí)驗(yàn)計(jì)劃-資料下載頁(yè)
2025-11-10 02:47本頁(yè)面
【正文】 值低于Lys的PI值，Lys可解離成陽(yáng)離子結(jié)合在樹(shù)脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹(shù)脂吸附而流出層析柱。在pH12條件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解離成陰離子從樹(shù)脂上被交換下來(lái)。這樣通過(guò)改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達(dá)到分離的目的。茚三酮反應(yīng)是指在加熱條件下，氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)生成紫色（與羥脯氨酸或脯氨酸反應(yīng)生成（亮黃色）化合物的反應(yīng)。該紫色化合物在570nm處有最大光吸收，所以可以利用分光光度計(jì)測(cè)量其含量。由于該反應(yīng)靈敏度高，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于氨基酸定性和定量的分析，國(guó)內(nèi)的大部分教材認(rèn)為其反應(yīng)機(jī)理為：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）但是大量實(shí)驗(yàn)表明而且大部分的學(xué)者認(rèn)為茚三酮顯色反應(yīng)生成的有色物質(zhì)是混合物而不是單一組分。茚三酮顯色反應(yīng)受pH，茚三酮試劑的配制方法和濃度，氨基酸種類(lèi)和濃度，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，冷卻時(shí)間，離子強(qiáng)度等都有較大影響。特別要注意的是pH對(duì)顯色反應(yīng)的影響特別大，且該反應(yīng)在一個(gè)小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定?！緦?shí)驗(yàn)器材和試劑】一、實(shí)驗(yàn)器材層析柱（20cm*1cm）；鐵架臺(tái)；恒流泵；部分收集器；分光光度計(jì)；移液槍?zhuān)缓銣厮″?；試管；玻璃棒；燒杯；試管架。二、?shí)驗(yàn)試劑①732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（100200目）生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）②2mol/L氫氧化鈉溶液，1mol/L氫氧化鈉溶液； ③2mol/L鹽酸溶液，； ④標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液天冬氨酸、賴(lài)氨酸均配制成2mg/； ⑤洗脫液檸檬酸氫氧化鈉鹽酸緩沖溶液（），定容至500mL，冰箱保存注：%酚溶液可防止長(zhǎng)霉。在室溫較高的夏季，配制緩沖溶液用的蒸餾水必須是新鮮蒸餾水，配前煮沸，配好后在4℃保存。（pH12），定容至1L ⑥顯色劑，加水定容至100mL。待測(cè)樣品混合氨基酸溶液：將2mg/mL天冬氨酸、賴(lài)氨酸溶液按1:，混合后再以1:?！静僮鞑襟E】對(duì)于市售干樹(shù)脂，先是經(jīng)水充分溶脹后，經(jīng)浮選得到顆粒大小合適的樹(shù)脂，然后加4倍量的2mol/LHCl溶液浸泡1小時(shí)，傾去酸液，用蒸餾水洗至中性，然后用2mol/LNaOH溶液處理，做法同上。以1mol/LNaOH溶液浸泡樹(shù)脂一小時(shí)轉(zhuǎn)化為鈉型，用蒸餾水洗至中性，最后用欲使用的檸檬酸緩沖液浸泡，過(guò)剩的樹(shù)脂浸入1mol/LNaOH溶液中保存，以防細(xì)菌生長(zhǎng)。2 裝柱取層析柱一支，垂直固定在鐵架臺(tái)上，(實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行檢漏，小老師會(huì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行演示)用夾子夾緊柱底出口處橡膠管，在柱內(nèi)加2~3cm高的檸檬酸緩沖液。將攪拌成懸浮狀的樹(shù)脂沿柱內(nèi)壁緩慢倒入。待樹(shù)脂在柱底部逐漸沉降時(shí)，慢慢打開(kāi)柱底出口處鐵夾，繼續(xù)加入樹(shù)脂懸浮液，直至樹(shù)脂高度到層析柱高度的3/4處。生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）注意：要注意裝柱過(guò)程的連續(xù)性，裝好的層析柱應(yīng)均勻，防止產(chǎn)生氣泡，節(jié)痕或界面，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有較大的影響，必須重新裝柱。3平衡層析柱裝好后，再緩慢沿管壁加入 適量緩沖液至樹(shù)脂床面以上2~3cm處，接上橫流泵，用pH試紙測(cè)量流出液pH，直至流出液的pH與緩沖液的pH相等。注意：調(diào)節(jié)流速前要排除恒流泵與柱間連接管內(nèi)所有氣泡，以免影響流速，影響實(shí)驗(yàn)效果。調(diào)節(jié)流速時(shí)統(tǒng)一將流速調(diào)節(jié)為10滴/min,平衡時(shí)間一般為15分鐘。4加樣關(guān)閉恒流泵，打開(kāi)層析柱上端管口，緩慢打開(kāi)柱底出口，小心放出層析柱內(nèi)的液體至柱內(nèi)液體的凹液面恰好與樹(shù)脂上液面相齊，立即關(guān)閉下端出口（注意：不要使液面下降至樹(shù)脂表面以下）。，沿靠近樹(shù)脂表面的管壁緩慢加入，注意不要沖壞樹(shù)脂表面。加樣后打開(kāi)柱底止水夾，使液體盡可能緩慢地流下至液體凹液面恰與樹(shù)脂表面相平，立即關(guān)閉止水夾。，打開(kāi)止水夾放出液體，使液體下表面與樹(shù)脂表面相平，按照此法清洗2次。然后小心加入緩沖液離柱頂部1cm為止，并將層析柱與恒流泵和部分收集器相連。注意：樣品體積不要過(guò)大，樣品的含量不能超過(guò)層析柱內(nèi)離子交換能力，否則影響分離效果。① 緩沖液洗脫：用檸檬酸緩沖液（）以6s/滴的流速開(kāi)始洗脫，用試管收集洗脫液，每管收集1ml，收集110號(hào)管。(② （pH12）洗脫：關(guān)閉恒流泵和止水夾，打開(kāi)止水夾進(jìn)行洗脫，同法收集1140管。收集完畢后，關(guān)閉止水夾和恒流泵。注意：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要多注意層析柱，避免使柱內(nèi)液體流干，否則實(shí)驗(yàn)即為失敗。，混勻后再加入1ml茚三酮顯色劑，混勻。沸水浴15min后取出，冷卻至室溫，在1h內(nèi)用分光光度計(jì)在570nm下以蒸餾水為空白管進(jìn)行比色，測(cè)定各管的吸光度值。注意：比色時(shí)盡量避免將液體沾在手上或衣服上。生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）層析柱使用幾次后，需將樹(shù)脂取出用1mol/LNaOH溶液洗滌，再用蒸餾水洗至中性后可反復(fù)使用。注意：在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后需將樹(shù)脂倒至指定燒杯中?！窘Y(jié)果與分析】以吸光度值為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制出洗脫曲線(xiàn)。以已知兩種氨基酸的純?nèi)芤簶悠?，按上述方法和條件分別操作，將得到的洗脫曲線(xiàn)與混合氨基酸的洗脫曲線(xiàn)對(duì)照，可確定2個(gè)峰的大致位置及各峰為何種氨基酸?！舅伎碱}】，然后用蒸餾水洗至中性，再用2mol/LNaOH攪拌半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，最后用1mol/LHCl攪拌半小時(shí)，還用蒸餾水洗至中性。請(qǐng)分析原因。，請(qǐng)思考樹(shù)脂過(guò)高或過(guò)低對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何影響，試分析原因。，若再加一個(gè)組氨酸，請(qǐng)估計(jì)其峰值的位置，說(shuō)明理由。
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