【正文】 的工藝(gōngy236。)路線（三）,化學(hu224。xu233。)破碎 （加變性劑）,離心除細胞(x236。bāo)碎片,除變性劑復性,62,第六十二頁，共七十四頁。,用化學法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解(r243。ngjiě)包涵體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設備和時間，比前兩者更適合于實驗室操作。 缺點是所有的可溶性雜質都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。,路線(l249。xi224。n)三：,63,第六十三頁，共七十四頁。,1）包涵(bāo hɑn)體的洗滌 細胞破碎后，包涵體呈顆粒狀，致密。 洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。 洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質類雜質。 洗滌劑濃度以溶解雜質，不溶解包涵體中表達產(chǎn)物為原則。,64,第六十四頁，共七十四頁。,2）目標蛋白的變性溶解 包涵體中不溶性的目標蛋白必須(b236。xū)溶解到液相中，才能進一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑： ▲ 58 mol/L鹽酸胍和68 mol/L尿素, 作用：破壞離子間相互作用； ▲ 表面活性劑如12％ SDS， 作用：破壞蛋白質肽鏈間的疏水相互作用。 ▲ PH9.0的堿溶液和有機溶劑，使用較少。 影響變性因素：時間、pH、離子強度、變性劑種類和濃度。,65,第六十五頁，共七十四頁。,原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質呈變性狀態(tài)，即蛋白質高級結構被破壞，但一級結構和共價鍵沒有破壞。當部分(b249。 fen)變性劑被除去后，蛋白質會重新折疊成具有活性的正確構型，該過程稱復性。 復性方法： 稀釋法除變性劑 － 加入大量水或緩沖液。 膜分離法除變性劑 － 透析、超濾、電滲析。 層析法：凝膠層析，高效疏水層析,3） 目標(m249。biāo)蛋白的復性,66,第六十六頁，共七十四頁。,蛋白質復性影響因素： 變性劑濃度 目標蛋白濃度； pH和離子(l237。zǐ)強度； 氧化還原條件。 還原劑： 二硫蘇糖醇、β巰基乙醇、還原型谷胱甘肽； 氧化劑： 氧化型谷胱甘肽。 堿性下通空氣。,67,第六十七頁，共七十四頁。,腫瘤壞死因子相關凋亡(diāo w225。nɡ)誘導配體蛋白在E.coli中的高密度發(fā)酵過程中以兩種形式表達： ◆ 細胞內(nèi)有活性的可溶性蛋白形式（約占目標蛋白的30%） ◆ 無活性的包涵體形式（約占目標蛋白的70%）。,懸浮(xu225。nf)破壁,PBS,洗滌(xǐd237。),離心,硫銨沉淀,親和層析,陽離子交換層析,溶解,復性,親和層析,濕菌體,發(fā)酵液,干凈菌體,上清液,包涵體,純品,活性檢測,破壁液,離心,離心液,洗滌,舉例：TRAIL的分離純化,68,第六十八頁，共七十四頁。,1. 包涵體的洗滌 ① 粗制包涵體用 50mM磷酸鹽緩沖液，含150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v) 洗滌23次； ② 用含有1M NaCl的磷酸(l237。n suān)緩沖液洗滌1次 (1:3 w/v)，將粘附其表面的大部 分蛋白及水溶性雜質除去； ③ 用6M尿素及0.5%TritonX100 聯(lián)合洗滌1次 (1:3 w/v)，去除另一些 雜蛋白，這時得較純包涵體（純度達80%左右）； ④ 用SDSPAGE電泳檢測純度。,2. 包涵(bāo hɑn)體的變性溶解 ① 洗滌后包涵體用含有30mM DTT（二硫代蘇糖醇）及5mol/l鹽酸胍的Tris 緩沖液 pH =8.0 (1:5 w/v)變性溶解 → 室溫攪拌2h，95%以上的包涵體可被溶解； ② 離心，13000rpm，20min → 棄沉淀得到溶解液。,69,第六十九頁，共七十四頁。,3. 包涵體復性（間歇式流加稀釋復性法） 以含DTT和ZnSO4的TrisHCl為復性緩沖液，再添加0.4M LArg，0.5M尿素，0.5M NaCl作為蛋白(d224。nb225。i)聚集抑制劑， 變性溶解液可多次流加，每次流加的時間是以上一次流加蛋白已達到部分復性為準。本實驗中，流加間隔時間確定為90min，每次流加濃度為150mg/L，變性液流加次數(shù)可高達6次，最終濃度可達到1mg/ml，4℃緩慢攪拌一段時間， 對50mM TrisHCl，300mM NaCl，0.1M尿素及0.2mM ZnSO4 混合液透析過夜，透析后離心除去復性過程中聚集的蛋白， 超濾濃縮（也可用硫酸銨沉淀進行濃縮）得復性蛋白液。,70,第七十頁，共七十四頁。,5. 復性后純化 復性濃縮(n243。nɡ suō)后蛋白 金屬親和層析 吸附 洗滌： 40mmol/L咪唑，洗除非特異性吸附的雜蛋白 洗脫： 100mmol/L咪唑 目標蛋白 純度達95%以上（由SDSPAGE和RPHPLC鑒定） 收率75%,71,第七十一頁，共七十四頁。,包涵體產(chǎn)物分離工藝(gōngy236。)（牛生長激素分離提?。?72,第七十二頁，共七十四頁。,思考題,常用的細胞破碎(p242。 su236。)方法有哪些 在選擇細胞破碎方法時需要考慮哪些因素？ 基因工程包涵體的純化方法。,73,第七十三頁，共七十四頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結,第三章 細 胞 破 碎。微生物（細菌(x236。jūn)/酵母/真菌）胞內(nèi)、胞外。可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。徑向盤使磨料沿徑向運動，傾斜盤則產(chǎn)生軸向運動。一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),。植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質變性才能使其形成可溶性的形式。層析法：凝膠層析，高效疏水層析。73,第七十四頁，共七十四頁。