20xx年醫(yī)學專題—免疫細胞的分離與檢測-資料下載頁
2024-11-04 23:07本頁面
【正文】 ④DNA內(nèi)切酶被激活，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp的特征性的有序片段。 ⑤Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。 流式細胞儀檢測法,第六十三頁，共七十五頁。,形態(tài)(x237。ngt224。i)觀察法,（1）普通光鏡檢測 HE染色 甲基綠派諾寧染色：細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要有細胞內(nèi)蛋白酶的激活，細胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達的增強。而細胞壞死是一種被動的細胞死亡過程，細胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根據(jù)(gēnj249。)這一特點，可應(yīng)用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性，使甲基綠對固縮細胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞，呈陰性染色者為壞死細胞。,二、細胞凋亡(diāo w225。nɡ)的檢測方法,第六十四頁，共七十五頁。,甲基綠派諾寧染色：光學顯微鏡下凋亡細胞和壞死細胞均表現(xiàn)為細胞固縮：其中凋亡細胞細胞核呈綠色(lǜ s232。)或綠藍色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染，壞死細胞只有固縮細胞，核綠色(lǜ s232。)著染，而細胞質(zhì)無染色。,第六十五頁，共七十五頁。,（2）熒光顯微鏡檢測—溴化丙錠（PI）染色(rǎns232。)： 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。,第六十六頁，共七十五頁。,（3）透射電子顯微鏡：已經(jīng)用于凋亡細胞的檢測。鏡下可見凋亡細胞體積變小、細胞質(zhì)濃縮、細胞核變小、染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)(n237。ngji233。)成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核邊集現(xiàn)象。晚期的凋亡細胞，清晰可見細胞核裂解產(chǎn)生的凋亡小體。,第六十七頁，共七十五頁。,生化(shēnɡ hu224。)檢測法,（1）凝膠電泳法： （2）原位末端標記法 （3）二苯胺(běn 224。n)分光光度法,二、細胞凋亡的檢測(jiǎn c232。)方法,第六十八頁，共七十五頁。,（1）凝膠電泳法,原理：凋亡細胞的突出特征是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導致細胞核DNA的斷裂。典型的細胞凋亡，在核內(nèi)形成大量200bp大小及其倍體的核苷酸片段，而非典型的凋亡細胞，由于核內(nèi)的DNA降解不完全，僅形成300~50kb的DNA大片。利用這一特性，可通過DNA凝膠電泳來判定凋亡的發(fā)生和發(fā)展情況。 方法：提取(t237。qǔ)總DNA DNA凝膠電泳 觀察DNA ladder現(xiàn)象,第六十九頁，共七十五頁。,凝膠電泳特點 (1) 本方法不能檢測(jiǎn c232。)單個細胞水平的凋亡。 (2) 不能提供細胞發(fā)生凋亡所處的組織位置和細胞分化狀態(tài)。,第七十頁，共七十五頁。,（2）原位末端標記法（TUNEL）,原理：利用標記的dUTP，在TdT作用下結(jié)合DNA斷片的3’末端羥基，顯示斷鏈DNA，提示凋亡 方法：制備組織(zǔzhī)切片 標記物結(jié)合 標記物顯色 鏡檢,第七十一頁，共七十五頁。,TUNEL染色：細胞核固縮有的呈碎片狀，不規(guī)則，大小不一致，呈棕黃色顆粒(kēl236。)者為陽性細胞。 即凋亡的細胞,第七十二頁，共七十五頁。,（3）二苯胺(běn 224。n)分光光度法,原理：細胞凋亡可產(chǎn)生(chǎnshēng)低分子量DNA，通過超速離心可與細胞核的高分子量DNA分離，分別測定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。 方法：裂解細胞 13000g超速離心 分別提取DNA 使DNA顯色，測定,第七十三頁，共七十五頁。,凋亡(diāo w225。nɡ)百分率 =,上清液OD值,上清液OD值+沉淀(ch233。ndi224。n)OD值,第七十四頁，共七十五頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),一、免疫細胞的特征。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。各孔細胞收集后依次通過生理鹽水，5%三氯乙酸和無水乙醇（獲得了存活的靶細胞的標記DNA）。細胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動死亡過程，也稱程序性死亡。意外事故(y236。 w224。i sh236。 ɡ249。)性細胞死亡，被動進行（他殺性）。上清液OD值。上清液OD值+沉淀OD值,第七十五頁，共七十
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