【導(dǎo)讀】論文中引用他人已經(jīng)發(fā)表或出版過(guò)的研究成果，文中已加了。對(duì)本研究及學(xué)位論文撰寫曾做出貢獻(xiàn)的老師、朋友、同仁。在文中作了明確說(shuō)明并表示衷心感謝。許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西南大學(xué)研究生院（籌）可以將學(xué)位。印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。■保密期限至20xx年7月止）。

　　

【正文】 標(biāo)簽法和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法的基本原理是一致的，只是 TDNA 標(biāo)簽法的突變由TDNA 的插入 所致。 Feldmann(Feldmann 1989) 通過(guò) 利用 TDNA 插入，得到了擬南芥的矮化突變體。 TDNA 標(biāo)簽法成功的關(guān)鍵是能否篩選出由轉(zhuǎn)座子插入所致的突變體。 表達(dá)序列標(biāo)簽法（ expressed sequence tag,EST）是在完整的基因上能夠特異性標(biāo)記基因的某一部分序列，從而與其它基因相區(qū)分，通常都包含了足夠的基因結(jié)構(gòu)信息區(qū)。大量的 EST克隆以及 EST 資料庫(kù)的建立，為使用生物信息學(xué)的方法克隆基因提供了前提條件。林慧賢（林慧賢等 20xx）利用 EST 克隆得到了 1 個(gè)新的水稻 GTP 蛋白基因 Osrab5B 的 cDNA 克??；Jantasuriyarat (Jantasuriyarat et )通過(guò) EST 克隆鑒定了水稻稻瘟病 感染的相關(guān)基因。 作物 QTL 克隆及其功能研究進(jìn)展 目前，擬南芥、水稻、番茄、玉米、馬鈴薯、甜菜、小麥、大麥、胡椒等作物都已經(jīng)有克隆 QTL 的報(bào)道，其中，利用圖位克隆法克隆得到的 QTL 主要來(lái)自番茄、擬南芥和水稻等模式植物。例如水稻抽穗期 QTL Hd Hd Hd3 和 Ehd1；而分別作用于番茄糖含量、果重和果形的 Brix92 和 Ovate；分別控 制玉米開花期、玉米果殼進(jìn)化和油分含量及組成成分的 Vgt tga1 和 DGAT。 玉米花色苷的研究進(jìn)展 花色苷的生理功能 花色苷的存在對(duì)植物體本身有許多重要的作用?；ò曛泻谢ㄉ帐蛊漕伾r艷，有利于花粉傳播和后代繁殖 （趙昶靈，郭華春 20xx） ，種子和果實(shí)中花色苷的積累有利于預(yù)防害蟲和紫外線的傷害，與其抗逆性密切相關(guān) （ Hichem et al. 20xx； Zhang et al. 20xx； Takele 20xx； Sperdouliamp。Moustakas 20xx） 。此外，花色苷對(duì)人體具 有多種生理保健功能?；ㄉ兆钪饕纳砘钚怨δ苁亲杂苫宄芰涂寡趸芰Γㄉ盏目寡趸芰κ?VE的 50倍， VC的 20倍，西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 10 而且其對(duì)人體的生物有效性是 100%，服用后 20分鐘就能在血液中檢測(cè)到（唐忠厚，周麗 20xx）。花色苷可以改善人和動(dòng)物的整體視覺(jué)功能，研究報(bào)道，花色苷提高視覺(jué)靈敏度的主要原因是花色苷刺激視網(wǎng)膜色素再生（ Matsumoto et al. 20xx） 。 Hou等發(fā)現(xiàn)花色苷可以阻塞有活性的分裂素蛋白至活酶路徑，從而有效抑制腫瘤的發(fā)生 （ Hou et al. 20xx）。 Makoto等發(fā)現(xiàn)花色苷提 取物可有效抑制突變作用 (Makoto et al. 20xx)?；ㄉ赵谘軆?nèi)皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激保護(hù)作用可以效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生 （ Youdim et al. 20xx）。 Tsuda等的試驗(yàn)證明花色苷可以作為功能保健食品，有效預(yù)防肥 胖和糖尿病 （ Tsuda et al. 20xx） 。到目前，花色苷的抗微生物活性已被確定，比如抑制黃曲霉生物活性 （ Norton 1999）。 花色苷常常與其他化學(xué)物質(zhì)協(xié)同作用發(fā)揮生理功能，而且在不同組織器官中，各種代謝對(duì)花色苷的吸收、利用以及在體內(nèi)積累的跟蹤調(diào)查也很復(fù)雜，這些都為花色 苷對(duì)人體的研究帶來(lái)困難，但同時(shí)也表明花色苷的研究還有更多的空間。 黑玉米是玉米栽培中的一個(gè)變種，因籽粒中色素成分含量高而成黑色（紫色）。黑玉米中的主要色素成分是花色苷?；ㄉ帐怯绍赵c葡萄糖以糖苷鍵形式結(jié)合形成的 一類廣泛存在于植物 體內(nèi) 的類黃酮多酚化合物（ 趙昶靈，郭華春 20xx；張建霞等， 20xx） ，是構(gòu)成植物花瓣、葉片、果實(shí)、種子等器官顏色的最主要水溶性色素（ Klein et al. 1989； Tanaka et al. 20xx；Park et al. 20xx）。 花色苷的結(jié)構(gòu)和代謝途徑 花 色苷是花色素甘元與葡萄糖以糖苷鍵形式結(jié)合，其結(jié)構(gòu)母核是 2苯基苯并吡喃陽(yáng)離子，屬于類黃酮化合物。自然界已知的花色苷根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的差異可以分為 22類 (Andersen et al. 20xx； Devia et al. 20xx)，其中食品中常見的包括 6類 (Escribano et al. 20xx)。即矢車菊色素（ 50%）、天竺葵色素（ 12%）、飛燕草色素（ 12%）、芍藥色素（ 12%）、牽牛色素（ 7%）和錦葵色素（ 7%）， 6類花色苷的結(jié)構(gòu)如圖 (Kong et al. 20xx)。自然條件下花色素（ anthocyanidins）通常與葡萄糖、木糖等糖類結(jié)合，其中矢車菊素 3葡萄糖苷在自然界中分布最廣 (Kong et al. 20xx)。黑（紫）玉米中所含的花色苷主要是矢車菊素 3葡萄糖苷（ Cy3glu），矢車菊素 3半乳糖苷（ Cy3gal），天竺葵色素 3葡萄糖苷（ Pg3glu），芍藥色素 3葡萄糖苷 Pn3glu等（ Dpascualteresa et al. 20xx； Cevalloscasals et al. 20xx）?；ㄉ盏纳锎x途徑是目前研究的最為廣泛和深入的植物 次生代謝途徑（ Bartel and Matsuda 20xx） 。玉米、金魚草和矮牽牛是研究花色苷代謝途徑并分離基因的重要物種，代謝途徑中的多數(shù)反應(yīng)在三個(gè)物種中相同，在某些反應(yīng)上不同的物種也存在差別。例如矮牽牛花通常情況下不產(chǎn)生天竺葵色素，玉米和金第 1 章 文獻(xiàn)綜述 11 魚草不能產(chǎn)生飛燕草色素。 圖 1 食品中主要花色苷的結(jié)構(gòu) Figure 1 The main structures of anthocyanins in food 表 2 各類花色苷的 R R2基團(tuán) Table 2 The R1 and R2 of each anthocyanin. 花色苷 Anthocyanin R1 R2 天竺葵色素 Pelargonidin H H 矢車菊色素 Cyanidin OH H 飛燕草色素 Delphinidin OH OH 芍藥色素 Peonidin OCH3 H 牽牛色素 Petunidin OCH3 OH 錦葵色素 Malvidin OCH3 OCH3 控制花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因 目前研究者從遺傳學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)等不同層面研究了植物花色苷的合成與分子調(diào)控，揭示出了花色苷合成途徑中的 10個(gè)相關(guān)酶，即苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、肉桂酸 4羥化酶（ C4H）、查爾酮合酶（ CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（ CHI）、黃烷酮 3羥化酶（ F3H）、類黃酮 3’ 羥化酶（ F3’ H）、類黃酮 3’ 5’ 羥化酶（ F3’ 5’ H）、二氫黃銅 4還原酶（ DFR）、花色苷合酶（ ANS）以及尿苷二磷酸葡萄糖 類黃酮 3O糖基轉(zhuǎn)移酶（ 3GT） （ Holton amp。 Cornish 1995；趙昶靈，郭華春 20xx； Tanaka amp。 Ohmiya, 20xx） 。植物中編碼這些酶的基因（結(jié)構(gòu)基因）均有克隆，其功能也均得到 詳細(xì)闡釋（ Holton amp。 Cornish 1995； WinkelShirley 20xx； Harborne amp。 Williamsburg 20xx； Martens et al. 20xx）。目前，玉米花色苷合成途徑中已報(bào)道的結(jié)構(gòu)基因有c whp、 chi pr f3h、 a a bz bz2等（ PazAres et al. 1990； Holton amp。 Cornish 1995； 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 12 Sharma et al. 20xx； 李義龍等 20xx； 劉海峰 20xx； Sharma et al. 20xx）。其中 c2基因編碼籽粒中的 CHS， whp基因編碼花粉中的 CHS， chi1基因編碼 CHI， pr1基因編碼 F3’ H， f3h基因編碼 F3H， a1基因編碼 DFR， a2基因編碼 ANS， bz1基因是通過(guò) Ac轉(zhuǎn)座元件克隆的，編碼 3GT，bz2編碼谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST），其主要是作用是在合成的花青素 3葡萄糖上添加一個(gè)谷胱甘肽，從而保護(hù)其在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不被氧化（ Marrs amp。 Walbot 1997； Alfenito et al. 1998）。 除此之外，在玉米中還分離出 r、 r(S)、 r(Sn)、 r(Lc)、 b、 c pl、 vp in anl zm等調(diào)節(jié)基因（ Holton 1995； Petroni et al. 20xx； Hernandez et al. 20xx；胡可等 20xx；李宗艷，李名揚(yáng) 20xx），這些基因的編碼產(chǎn)物并非花色苷合成途徑中的酶，但是其表達(dá)水平，也會(huì)明顯影響玉米植株、籽粒、穗軸等器官中色素的積累。在這些調(diào)節(jié)基因中， r、 r(S)、 c1與 pl這 4個(gè)基因調(diào)節(jié)編碼 CHS、 DFR與 3GT等酶的基因， r(Sn)與 r(Lc)則調(diào)節(jié)編碼 CHS與 DFR的基因， b則調(diào)節(jié)編碼 DFR與 3GT的基因， vp1是 c1的調(diào)節(jié)基因（ Holton amp。 Cornish 1995）。 in1基因在隱性純合狀態(tài)下會(huì)增強(qiáng)籽粒糊粉層花色苷積累，在顯性純合狀態(tài)下則會(huì)抑制糊粉層花色苷的積累， anl1基因是從玉米籽粒糊粉層花色苷缺失的材料中鑒定的一個(gè)隱性致死基因。除此以外， Selinger（ Selingeramp。Chandler 1999）通過(guò) Mu轉(zhuǎn)座元件誘變，分離到一個(gè)新的影響籽粒糊粉層顏色的調(diào)節(jié)基因 pac1（ pale aleurone color1），該基因表現(xiàn)為隱性非致死，并且僅在籽粒中表達(dá)。與其它調(diào)節(jié)基因不同， pac1可以調(diào)節(jié)整個(gè)花 色苷合成途徑中的不同結(jié)構(gòu)基因（ Selinger amp。 Chandler 1999）。 從這些基因表達(dá)的組織特異性來(lái)看，結(jié)構(gòu)基因大多沒(méi)有嚴(yán)格的組織特異性，調(diào)節(jié)基因則不同，其中 c in1與 pac1僅在籽粒中表達(dá)（ Selinger amp。 Chandler 1999）， pl的等位基因則基本都在植株中表達(dá)（ Cone et al. 1993）。因此，有研究結(jié)果指出，在玉米籽粒顏色的進(jìn)化過(guò)程中，調(diào)節(jié)基因的作用更為重要。從分離的這些基因的染色體分布來(lái)看， 9個(gè)結(jié)構(gòu)基因分別分布于 9等染色體上， 12個(gè)調(diào)節(jié)基因則分布 于 9等染色體（ 第 2 章 引言 13 第 2 章 引言 本研究的意義和目的 玉米籽粒中色素的成分和含量與玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān)。不同顏色的玉米中所含的色素成分不同 (崔麗娜等 20xx)。普通黃玉米主要是類胡蘿卜素，而黑玉米主要是花色苷?；ㄉ諏儆诜宇惿兀怪参锞哂絮r艷的顏色，利于授粉和種子傳播、抵抗植物蟲害等功能 (Holton amp。 Cornish 1995)。更重要的是花色苷對(duì)人 體具有抗氧化、抗癌以及保護(hù)心腦血管等多種生理保健功能 (Jones K 20xx；王金亭等 20xx)。因此，黑玉米中的花色苷既可作為天然食用色素，又可作為抗氧化劑用于醫(yī)藥、保健品和化妝品，具有廣闊的應(yīng)用前景。 早期有關(guān)玉米色素的研究主要是易于觀察的色澤變異。 在 二十 世 紀(jì)初，植物學(xué)家對(duì)玉米紅色和藍(lán)色籽粒的分離現(xiàn)象就很重視，他們通過(guò)大量雜交試驗(yàn)，研究了玉米的色澤變異與基因位點(diǎn)（ Emerson R ； Hayes H K. 1917； Anderson 1924； Anderson 1927； Emerson 1932；Rhoades 1936）。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，玉米色素相關(guān)基因的定位也取得了進(jìn)展。 Sourdille等（ Sourdille 1996） 對(duì)含 392單株的 F2群體的葉緣、主莖、穎片和花絲等顏色基因的 QTL定位，共檢測(cè)到 8個(gè)位點(diǎn)，分別位于第 第 第 第 第 第 第 10染色體，其中第 2和第 10染色體上的 QTL對(duì)表型的貢獻(xiàn)率最大。 Brown等（ Brown 20xx）利用 IL731AW6786W的 F2:3群體，通過(guò) RFLP標(biāo)記，對(duì)控制玉米葉片、果皮、莖稈等顏色的基因進(jìn)行 QTL定位，檢測(cè)到 2個(gè)與花色苷含量相關(guān)的 QTL，位于第 10和第 5染色體，分別解釋表型變異的 %和 %。近年來(lái)陳永欣（ 陳永欣等 20xx）等對(duì)黑糯玉米主要標(biāo)志性狀及色澤遺傳規(guī)律進(jìn)行了研究，表明黑糯玉米屬于果皮遺傳 ， 其植株各部位色澤為連鎖遺傳 ， 色澤具有部分加性效應(yīng)。崔麗娜等（ 崔麗娜 20xx）通過(guò)徒手切片和分光光度法，研究玉米籽粒顏色的組成、分布和積累規(guī)律，表明不同顏色的玉米其色素組成和分布均不同。孫玲凌等（ 孫凌玲 20xx）利用自交系 K12和瓊 68的 F2和 BC1群體對(duì)玉米紅花絲進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn) K12的紅花絲由 1對(duì)顯性 基因控制，利用數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀結(jié)合的基因定位方法，將該基因定位在第 10染色體上，與 SSR標(biāo)記 umc1576之間的遺傳距離為 cM。 Lee等（ Lee E A 20xx）用 2個(gè)白玉米自交系 (其中一個(gè)自交系籽粒上有紫色條紋 )構(gòu)建了 F2:3群體，采用 58個(gè) SSR標(biāo)記， 2年重復(fù)檢測(cè)到 1個(gè)控制白玉米籽粒上紫色條紋的 QTL，位于第 6染色體，其最近標(biāo)記為 umc1979，從而推測(cè)控制 PKS的基因就是與這個(gè)位點(diǎn)緊密相連的 pl1基因。袁文娟等（ 袁文娟 20xx）利用黑玉米自