【正文】 和替換系（ Substitution 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 6 lines， SLs），它們都是通過(guò)連續(xù)重復(fù)的回交和分子標(biāo)記輔助選擇來(lái)完成的。從近等基因系發(fā)展而來(lái)的分離群體，只在與親本有差異的染色體區(qū)域發(fā)生分離，從而消除背景的干擾及主效 QTL 對(duì)微效 QTL 的掩蓋作用。 利用近等基因系對(duì) QTL 精細(xì)定位 Takeuchi 等（ Takeuchi et al. 20xx）用一個(gè)只含有單個(gè)供體染色體片段 的近等基因系群體（ 96 株），對(duì)水稻的兩個(gè)緊密連鎖的 QTL：種子休眠性（ Seed dormancy） QTLSdr1 和抽穗天數(shù) QTLHd8 進(jìn)行 精細(xì)定位，將 Sdr1 定位在 RFLP 標(biāo)記 R10942 和 C2045 之間，與 C1488共分離； 將 Hd8 定位于 RFLP 標(biāo)記 C1534S 和 R10942 之間。 Murai（ Murai et al. 20xx）用近等基因系分離群體把水稻抗褐飛虱抗性基因 bph2 定位在 cM 的范圍之內(nèi)，距離 AFLP 標(biāo)記 KAM3 的遺傳距離為 cM，距標(biāo)記 KAM5 的遺傳距離為 cM，與標(biāo)記 KAM4 共分離。進(jìn)一步研究表明，在田間條件下，控制水稻的抽穗天數(shù)的 QTLHd2 對(duì)另一個(gè)控制抽穗天數(shù)的 QTLHd6 也有上位性互作效應(yīng)，即 Hd2 的存在掩蓋Hd6 對(duì)延長(zhǎng)抽穗天數(shù)的特性（ Yamamotoet a1. 20xx）。進(jìn)一步的分析表明，Hd1 基因與控制擬南芥開(kāi)花期的基因 CONSTANS 相似。 Blair（ Blair et al． 20xx）利用含有 1016個(gè)單株的的等基因系群體把控制水稻抗白葉枯病的基因 Xa5 定位于 70KB 的范圍內(nèi)，該區(qū)域內(nèi)包含 11 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ ORF： open reading frame）。用染色體著陸法（ chromosome landing）把 xa27 定位于 cM 的基因組范圍之內(nèi)，處于分子標(biāo)記 M964 和 M1197 之間，與分子標(biāo)記 M63 M1230 和 M499 共分離。然后經(jīng)多次重復(fù)回交，把優(yōu)良性狀如抗病性、抗蟲(chóng)性導(dǎo)人栽培品種中。也就是說(shuō)近等基因系是遺傳背景相同，然而等位基因性質(zhì)不同的一組品系，在過(guò)去的研究中，由于品種之間遺傳背景的不同，往往無(wú)法比較出控制品種間某個(gè)性狀的基因型的差異，而應(yīng)用近等基因第則可以克服這種困擾。 Bcmacchi（ Bcmacchi et a1. 1998）定位番茄的 15 個(gè)基因組區(qū)段作為目標(biāo)，通過(guò) RFLP 標(biāo)記輔助選擇，建立了 23 個(gè)含有單個(gè)供體染色體片段 的近等基因系，并進(jìn)一步對(duì)這些近等基因系的控制 7 個(gè)性狀的 25 個(gè)數(shù)量性狀因子進(jìn)行效應(yīng)分析。 Saito（ Saito et a1. 20xx）依據(jù)早代用雙單倍體群體對(duì)水稻根部性狀 QTL 定位的結(jié)果，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇以及回交跟蹤 4 個(gè)目標(biāo)區(qū)段，構(gòu) 建了水稻根部性狀的 29個(gè)近等基因系；其中， 1 個(gè)近等基因系可以明顯改良受體親本 IR64 的根部性狀， 3 個(gè)近等基因系可以明顯改良水稻的深水根重， 1 個(gè)近等基因系可以明顯改良水稻的最大根長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)近等基因的分析，表明多態(tài)性的片段可能就是和目標(biāo)基因相連鎖的分子標(biāo)記，并且可對(duì)分離后代的分析來(lái)驗(yàn)證（姚景俠等， 1990；鐘少斌等， 1993；劉金元， 1996；李松濤等， 1995；賈繼增等， 1996；樸春根等， 1997；劉秉華， 1997）?；蚩寺∈鞘褂皿w外西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 8 重組技術(shù)把特定的基因和其它 DNA 順序插入到載體分子內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，其目標(biāo)就是識(shí)別分離出來(lái)的特異基因并獲得基因的完整序列，確定染色體的定位，以及闡明其機(jī)理，并利用生物工程手段將其應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去。在生物種、屬之間，基因編碼區(qū)的同源性一般都比非編碼區(qū)的高，如果克隆其他種、屬的同源序列，構(gòu)建含目標(biāo)基因的 cDNA 文庫(kù)，然后用已知的基因序 列作為探針，可以克隆到同源基因。 Martin (Martin B et al. 1997)用綠豆 C4H 基因的 cDNA 作為探針，從擬南芥的 cDNA 文庫(kù)中篩選出編碼肉桂酸 4羥基酶的基因 (C4H)。同時(shí)，由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的存在，推導(dǎo)出具有特異的探針是很難的。 其次，對(duì)未知產(chǎn)物基因克隆的方法主要有：圖位克隆法、同源序列法、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、差異基因表達(dá)的分離方法和表達(dá)序列標(biāo)簽法（ EST）。眾多研究者已經(jīng)用圖位克隆法分離和克隆了很多基因，例如擬南芥的脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)基因 ABI3 (Giraudat et al.， 1992 )和ω 3 脂肪酸脫飽和酶基因 FAD3 (Arondel et al.， 1992)，番茄抗霜 霉病基因 Cf2 基因 (Dixon et al.， 1996)和 Pto (Martin et al.，1993)，水稻的分蘗數(shù)基因 Moc1（ Li et al.， 20xx）、水稻矮桿基因 dll (Tanabeet al.， 20xx)，大麥抗白粉病基因 Mol (McDowell et al.， 1998)，小麥抗線蟲(chóng)基因 Cre3 (Lagudahet al.， 1997)，甜菜的 Hslpro1 基因 (Cai et al.， 1997) 及 200 多個(gè)與人類(lèi)遺傳性疾病相關(guān)的基因克隆等。使用圖位克隆的方法克隆基因的前提是： 需要完整的基因組文庫(kù)， 飽和的分子標(biāo)記連鎖圖， 完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系， 第 1 章 文獻(xiàn)綜述 9 大量的測(cè)序工作。 轉(zhuǎn)座子或 TDNA 標(biāo)簽法。以轉(zhuǎn)座子 DNA 為探針，經(jīng)過(guò) 篩選變異株的基 因文庫(kù)，找到該轉(zhuǎn)座子的部分片段，再以突變基因的部 分序列作探針，從野生型文庫(kù)里 克隆出完整的基因。自從 Fedoroff ( Fedoroff et )首次通過(guò)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法從玉米中克隆出 Bz1 基因以來(lái)，已從玉米中克隆出了 A1 基因、 C1 基因、 Kn1 基因、 Bz2 等基因，從金魚(yú)草中克隆出 Deficiens 基因 (顧紅雅， 1995)、 Pa1基因。 Feldmann(Feldmann 1989) 通過(guò) 利用 TDNA 插入，得到了擬南芥的矮化突變體。 表達(dá)序列標(biāo)簽法（ expressed sequence tag,EST）是在完整的基因上能夠特異性標(biāo)記基因的某一部分序列，從而與其它基因相區(qū)分，通常都包含了足夠的基因結(jié)構(gòu)信息區(qū)。林慧賢（林慧賢等 20xx）利用 EST 克隆得到了 1 個(gè)新的水稻 GTP 蛋白基因 Osrab5B 的 cDNA 克?。籎antasuriyarat (Jantasuriyarat et )通過(guò) EST 克隆鑒定了水稻稻瘟病 感染的相關(guān)基因。例如水稻抽穗期 QTL Hd Hd Hd3 和 Ehd1；而分別作用于番茄糖含量、果重和果形的 Brix92 和 Ovate；分別控 制玉米開(kāi)花期、玉米果殼進(jìn)化和油分含量及組成成分的 Vgt tga1 和 DGAT。花瓣中含有花色苷使其顏色鮮艷，有利于花粉傳播和后代繁殖 （趙昶靈，郭華春 20xx） ，種子和果實(shí)中花色苷的積累有利于預(yù)防害蟲(chóng)和紫外線的傷害，與其抗逆性密切相關(guān) （ Hichem et al. 20xx； Zhang et al. 20xx； Takele 20xx； Sperdouliamp。此外，花色苷對(duì)人體具 有多種生理保健功能?；ㄉ湛梢愿纳迫撕蛣?dòng)物的整體視覺(jué)功能，研究報(bào)道，花色苷提高視覺(jué)靈敏度的主要原因是花色苷刺激視網(wǎng)膜色素再生（ Matsumoto et al. 20xx） 。 Makoto等發(fā)現(xiàn)花色苷提 取物可有效抑制突變作用 (Makoto et al. 20xx)。 Tsuda等的試驗(yàn)證明花色苷可以作為功能保健食品，有效預(yù)防肥 胖和糖尿病 （ Tsuda et al. 20xx） 。 花色苷常常與其他化學(xué)物質(zhì)協(xié)同作用發(fā)揮生理功能，而且在不同組織器官中，各種代謝對(duì)花色苷的吸收、利用以及在體內(nèi)積累的跟蹤調(diào)查也很復(fù)雜，這些都為花色 苷對(duì)人體的研究帶來(lái)困難，但同時(shí)也表明花色苷的研究還有更多的空間。黑玉米中的主要色素成分是花色苷。 花色苷的結(jié)構(gòu)和代謝途徑 花 色苷是花色素甘元與葡萄糖以糖苷鍵形式結(jié)合，其結(jié)構(gòu)母核是 2苯基苯并吡喃陽(yáng)離子，屬于類(lèi)黃酮化合物。即矢車(chē)菊色素（ 50%）、天竺葵色素（ 12%）、飛燕草色素（ 12%）、芍藥色素（ 12%）、牽牛色素（ 7%）和錦葵色素（ 7%）， 6類(lèi)花色苷的結(jié)構(gòu)如圖 (Kong et al. 20xx)。黑（紫）玉米中所含的花色苷主要是矢車(chē)菊素 3葡萄糖苷（ Cy3glu），矢車(chē)菊素 3半乳糖苷（ Cy3gal），天竺葵色素 3葡萄糖苷（ Pg3glu），芍藥色素 3葡萄糖苷 Pn3glu等（ Dpascualteresa et al. 20xx； Cevalloscasals et al. 20xx）。玉米、金魚(yú)草和矮牽牛是研究花色苷代謝途徑并分離基因的重要物種，代謝途徑中的多數(shù)反應(yīng)在三個(gè)物種中相同，在某些反應(yīng)上不同的物種也存在差別。 圖 1 食品中主要花色苷的結(jié)構(gòu) Figure 1 The main structures of anthocyanins in food 表 2 各類(lèi)花色苷的 R R2基團(tuán) Table 2 The R1 and R2 of each anthocyanin. 花色苷 Anthocyanin R1 R2 天竺葵色素 Pelargonidin H H 矢車(chē)菊色素 Cyanidin OH H 飛燕草色素 Delphinidin OH OH 芍藥色素 Peonidin OCH3 H 牽牛色素 Petunidin OCH3 OH 錦葵色素 Malvidin OCH3 OCH3 控制花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因 目前研究者從遺傳學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)等不同層面研究了植物花色苷的合成與分子調(diào)控，揭示出了花色苷合成途徑中的 10個(gè)相關(guān)酶，即苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、肉桂酸 4羥化酶（ C4H）、查爾酮合酶（ CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（ CHI）、黃烷酮 3羥化酶（ F3H）、類(lèi)黃酮 3’ 羥化酶（ F3’ H）、類(lèi)黃酮 3’ 5’ 羥化酶（ F3’ 5’ H）、二氫黃銅 4還原酶（ DFR）、花色苷合酶（ ANS）以及尿苷二磷酸葡萄糖 類(lèi)黃酮 3O糖基轉(zhuǎn)移酶（ 3GT） （ Holton amp。 Ohmiya, 20xx） 。 Cornish 1995； WinkelShirley 20xx； Harborne amp。目前，玉米花色苷合成途徑中已報(bào)道的結(jié)構(gòu)基因有c whp、 chi pr f3h、 a a bz bz2等（ PazAres et al. 1990； Holton amp。其中 c2基因編碼籽粒中的 CHS， whp基因編碼花粉中的 CHS， chi1基因編碼 CHI， pr1基因編碼 F3’ H， f3h基因編碼 F3H， a1基因編碼 DFR， a2基因編碼 ANS， bz1基因是通過(guò) Ac轉(zhuǎn)座元件克隆的，編碼 3GT，bz2編碼谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST），其主要是作用是在合成的花青素 3葡萄糖上添加一個(gè)谷胱甘肽，從而保護(hù)其在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不被氧化（ Marrs amp。 除此之外，在玉米中還分離出 r、 r(S)、 r(Sn)、 r(Lc)、 b、 c pl、 vp in anl zm等調(diào)節(jié)基因（ Holton 1995； Petroni et al. 20xx； Hernandez et al. 20xx；胡可等 20xx；李宗艷，李名揚(yáng) 20xx），這些基因的編碼產(chǎn)物并非花色苷合成途徑中的酶，但是其表達(dá)水平，也會(huì)明顯影響玉米植株、籽粒、穗軸等器官中色素的積累。 Cornish 1995）。除此以外， Selinger（ Selingeramp。與其它調(diào)節(jié)基因不同， pac1可以調(diào)節(jié)整個(gè)花 色苷合成途徑中的不同結(jié)構(gòu)基因（ Selinger amp。 從這些基因表達(dá)的組織特異性來(lái)看，結(jié)構(gòu)基因大多沒(méi)有嚴(yán)格的組織特異性，調(diào)節(jié)基因則不同，其中 c in1與 pac1僅在籽粒中表達(dá)（ Selinger amp。因此，有研究結(jié)果指出，在玉米籽粒顏色的進(jìn)化過(guò)程中，調(diào)節(jié)基因的作用更為重要。不同顏色的玉米中所含的色素成分不同 (崔麗娜等 20xx)?；ㄉ諏儆诜宇?lèi)色素，使植物具有鮮艷的顏色，利于授粉和種子傳播、抵抗植物蟲(chóng)害等功能 (Holton amp。更重要的是花色苷對(duì)人 體具有抗氧化、抗癌以及保護(hù)心腦血管等多種生理保健功能 (Jones K 20xx；王金亭等 20xx)。 早期有關(guān)玉米色素的研究主要是易于觀察的色澤變異。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，玉米色素相關(guān)基因的定位也取得了進(jìn)展。 Brown等（ Brown 20xx）利用 IL731AW6786W的 F2:3群體，通過(guò) RFLP標(biāo)記，對(duì)控制玉米葉片、果皮、莖稈等顏色的基因進(jìn)行 QTL定位，檢測(cè)到 2個(gè)與花色苷含量相關(guān)的 QTL，位于第 10和第 5染色體，分別解釋表型變異的 %和 %。崔麗娜等（ 崔麗娜 20xx）通過(guò)徒手切片和分光光度法，研究玉米籽粒顏色的組成、分布和積累規(guī)律，表明不同顏色的玉米其色素組成和分布均不同。 Lee等（ Lee E A 20xx）用 2個(gè)白玉米自交系 (其中一個(gè)自交系籽粒上有紫色條紋 )構(gòu)建了 F2:3群體，采用 58個(gè) SSR標(biāo)記， 2年重復(fù)檢測(cè)到 1個(gè)控制白玉米籽粒上紫色條紋的 QTL，位于第 6染色體，其最近標(biāo)記為 umc1979，從而推測(cè)控制 PKS的基因就是與這個(gè)位點(diǎn)緊密相連的 pl1