【正文】 做如下處理： 第一支：急速冷卻 ， 接種檢樣均質(zhì)液 1 mL～ 2 mL； 第二支：冷卻至 60℃ ， 接種檢樣 ， 繼續(xù) 60℃ 保溫 10min， 急速冷卻； 第三支：接種檢樣 ， 繼續(xù)煮沸加熱 10 min， 急速冷卻 。 以上 3支試管于 30℃ 厭氧培養(yǎng) 5d， 假設(shè)無生長 ， 可再培養(yǎng) 10d。 培養(yǎng)到期 ， 假設(shè)有生長 ， 取培養(yǎng)液離心 ， 以其上清液進行毒素檢測試驗， 方法同上 ， 陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在 。 〔 2〕肉毒梭菌的檢出〔增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗〕 第一百零八頁，共一百三十頁。 選取證實含有肉毒毒素的增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物 〔 必要時可重復(fù)一次適宜的加熱處理 〕接種卵黃瓊脂平板 ， 35℃ 厭氧培養(yǎng) 48 h。 肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時 ， 菌落及周圍培養(yǎng)基外表覆蓋著特有的虹彩樣 (或珍珠層樣 )薄層 。 根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落 ， 接種庖肉培養(yǎng)基 ， 于 30℃ 培養(yǎng) 5d， 進行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗 。 〔 3〕別離培養(yǎng) 〔 1〕毒素檢測：試驗方法同上。 〔 2〕培養(yǎng)特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成兩份，分別在 35℃ 的需氧和厭氧條件下培養(yǎng) 48 h，觀察生長情況及菌落形態(tài)。肉毒梭菌只在厭氧條件下生長而在需氧條件下不生長。 第一百零九頁，共一百三十頁。 結(jié)果報告 報告 (一 )：檢樣含有某型肉毒毒素。 報告 (二 )：檢樣含有某型肉毒梭菌。 報告 (三 )：由樣品別離的菌株為某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌檢驗?zāi)繕酥饕嵌舅兀还苁称分械娜舛径舅貦z驗還是肉毒梭菌檢驗，均以毒素的檢測及定型試驗為判定的主要依據(jù)。 第一百一十頁，共一百三十頁。 VIII 李斯特菌屬簡介 ? ?伯杰氏鑒定細菌學手冊 ?第 9版中，李斯特菌屬有 7個種：單核細胞增生李斯特氏菌〔 L. monocytogenes〕、英諾克李斯特氏菌〔 L. innocua〕 、西爾李斯特氏菌〔 L. seeligeri〕 、威爾斯李斯特氏菌〔 L. welshimeri〕 、綿羊李斯特氏菌〔 L. ivanovvi〕 、格氏李斯特氏菌〔 L. grayi〕 、默氏李斯特氏菌〔 L. murrayi〕 。 ? 單核細胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動物的感染，也可引起人的感染。 第一百一十一頁，共一百三十頁。 單核細胞增生李斯特氏菌 —— 生物學特性 形態(tài)特征： 革蘭氏陽性短桿菌 ， 大小為~ ~2μm， 兩端鈍圓 ，常兩兩相串成彎曲及 V形 ， 偶爾有球狀 、 雙球狀 、 短鏈狀 ， 但很少有長鏈狀 ， 兼性厭氧 、 無芽孢 ， 一般不形成莢膜 。 該菌有 4根周毛和 1根端毛 ， 周毛易脫落 。 20℃ 培養(yǎng)后可見到很多鞭毛 。 第一百一十二頁，共一百三十頁。 培養(yǎng)特性： 生長溫度為 2~42℃ 〔冷藏不能阻止該菌的生長〕，最適生長溫度為 35~37℃ 。 20~25 ℃ 培養(yǎng)有動力， 37 ℃ 培養(yǎng)動力消失；在顯微鏡下觀察該菌新鮮的室溫肉湯培養(yǎng)物可見翻筋斗運動。 在 ~，在 pH中性至弱堿性〔 〕、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好， 在 %NaCl肉湯中也能良好生長。 血平板上：菌落通常不大呈灰白色， 刺種血平板可產(chǎn)生窄小的 β溶血環(huán)。 單核細胞增生李斯特氏菌 — 生物學特性 第一百一十三頁，共一百三十頁。 單核細胞增生李斯特氏菌 — 抵抗力 ? 該菌耐酸，不耐堿；耐低溫〔 4℃ 可生存和繁殖〕； 不耐熱〔 55℃ ， 30min或 60～ 70℃ ， 10～ 20min可被 殺死〕。 ? 能抵抗亞硝酸鹽食品防腐劑；在 10％ NaCl中可生長。 ? 對化學殺菌劑及紫外線照射較敏感， 75%酒精 5min， %新潔爾滅 30min，紫外線照射 15min均可殺死。 ? 對多種抗生素敏感，以氨芐青霉素加上一種氨基糖苷抗生素為特效治療藥，對磺胺、多黏菌素等具耐藥性 第一百一十四頁，共一百三十頁。 ? 抗原構(gòu)造 : 根據(jù)該菌的菌體 (O)抗原和鞭毛 (H)抗原 的不同，將其分為 13種血清型。各型對人類均可致病，但以 1a和 1b最為多見。 ? 致病因素 : 該菌的毒株在血瓊脂平板上產(chǎn)生溶血素 O(LLO)，能使紅血球 β溶血，并具有破壞人體吞噬 細胞能力。 LLO是由504個氨基酸組成的簡單蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量為 60 000u，能被巰基化合物 (如半胱 氨酸 )激活，在 ，于 呈現(xiàn) 活性。 第一百一十五頁，共一百三十頁。 ? 中毒原因 :食了入含有溶血素 O的食品。如飲用未徹底殺死該菌的消毒乳，食用污染了該菌的冷藏的熟食品、乳與乳制品。 ? 中毒機理：該菌隨食物攝入后，在腸道內(nèi)很快繁殖，入侵各局部組織 (包括孕婦的胎盤 )，進入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過血流到達其他敏感的體細胞，并在其中繁殖，利用溶血素 O的溶解作用逃逸出吞噬細胞，并利用兩種磷脂酶的作用 (分解細胞膜磷脂分子的頭部極性基團 )在細胞間轉(zhuǎn)移，引起炎癥反響。 第一百一十六頁，共一百三十頁。 ?引起中毒的食品和污染途徑： ? 引起中毒的食品主要是乳與乳制品 (消毒乳、軟干酪等 )、新鮮和冷凍的肉類及其制品、家禽、海產(chǎn)品、水果和蔬菜。其中尤以乳制品中的軟干酪、冰淇淋、即食食品最為多見。 ? 帶菌人和哺乳動物的糞便是主要污染源。其主要傳播途徑是糞便 食品入口，還可通過胎盤和產(chǎn)道感染新生兒。胎兒或嬰兒的感染多半來自母體中的細菌或帶菌的乳制品。 ? 預(yù)防中毒措施： ? 防止原料和熟食品被污染；嚴格制定有關(guān)食品法規(guī)；利用加熱殺滅病原菌。 第一百一十七頁，共一百三十頁。 FDA BAM單核細胞增生李斯特氏菌檢驗流程 檢樣 25g 增菌 EB增菌液根底 225mL 30℃ 4h 參加抑菌劑 30℃ 20h 30℃ 44h 選擇性別離培養(yǎng) 接種 OXA和 PALCAM 接種 OXA和 PALCAM 35℃ 2448h 35℃ 2448h 生化鑒定 TSAYE純培養(yǎng) 30℃ 2448h 典型運動 TSBYE 過氧化氫酶試驗 革蘭氏染色 溶血試驗 麥芽糖 葡萄糖 硝酸鹽復(fù)原試驗 甘露醇 七葉苷 鼠李糖 木糖 SIM動力 培養(yǎng) 24h 培養(yǎng) 48h 目前單核細胞增生李斯特菌檢驗多采用國標法 (GB/T )。 第一百一十八頁，共一百三十頁。 ISO單核細胞增生李斯特氏菌檢驗流程 測試樣品〔 x g或 x mL〕 +9x mL一次增菌培養(yǎng)基〔 Half Fraser肉湯〕 30℃ 培養(yǎng) 24177。 2h 1mL培養(yǎng)液參加 劃線接種 Oxford瓊脂 10mL二次增菌培養(yǎng)基中 和 PALCAM瓊脂 〔 Fraser肉湯〕 35℃ 或 37℃ 培養(yǎng) 48177。 2h 30℃ 、 35℃ 或 劃線接種 Oxford瓊脂 37℃ 培養(yǎng) 2448h 和 PALCAM瓊脂 30℃ 、 35℃ 或 37℃ 培養(yǎng) 2448h 李斯特菌屬確實證： 挑取可疑菌接種 TSAYE培養(yǎng)基 過氧化氫酶試驗 革蘭氏染色 動力試驗 單核細胞增生李斯特菌確實證： 溶血試驗 碳源利用試驗 CAMP〔協(xié)同溶血〕試驗 第一百一十九頁，共一百三十頁。 單核細胞增生李斯特氏菌選擇性別離培養(yǎng) OXA瓊脂 FDA：灰黑色菌落，周圍有黑色環(huán)。 ISO：生長在牛津瓊脂上 24h的典型李 斯特氏菌呈小〔 1mm〕、灰色的菌落 外圍是黑色的暈輪； 48h后菌落變暗，可能見到綠色的輝光，直徑約 2mm。 有黑色的暈輪并且中間凹陷。 Oxford 瓊脂平板培養(yǎng)于 30℃ 適合于僅受額外菌群輕度污染的食品，對于受額外菌群重度污染的食品，最好培養(yǎng)于 35℃ 或 37℃ ，因為李斯特氏菌趨于和額外菌群一同生長。 第一百二十頁，共一百三十頁。 單核細胞增生李斯特氏菌選擇性別離培養(yǎng) PALCAM瓊脂 菌名 生長情況 菌落形態(tài)及培養(yǎng)基變化 大腸桿菌 完全抑制 培養(yǎng)基顏色無變化 金黃色葡萄球菌 部分抑制 菌落及其周圍培養(yǎng)基變黃 糞鏈球菌 完全抑制 培養(yǎng)基顏色無變化 英諾克李斯特氏菌 生長良好 灰綠色菌落 ， 周圍培養(yǎng)基變黑 綿羊李斯特氏菌 生長良好 灰綠色菌落 ， 周圍培養(yǎng)基變黑 單增李斯特氏菌 生長良好 灰綠色菌落 ， 周圍培養(yǎng)基變黑 ISO：對于微需氧培養(yǎng)的平板，培養(yǎng)后將平板暴露在空氣中 1h， 使得培養(yǎng)基重新恢復(fù)其品紅至紫色。經(jīng)過 24h培養(yǎng)后，李斯特氏菌呈小或細小的灰綠色或橄欖綠色菌落，有時中心黑色，但常常帶有黑色的暈圈。 48h培養(yǎng)后，呈現(xiàn)直徑 ，中心下陷并圍有黑色的暈圈。 第一百二十一頁，共一百三十頁。 李斯特氏菌屬 —— 動力和過氧化氫酶試驗 傘狀動力 ? 挑取 TSBYE肉湯培養(yǎng)物穿刺接種 SIM或半固體動力培養(yǎng)基 試管 ， 25℃ 培養(yǎng)