【正文】 從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。 （ 5） siRNA不僅能引導(dǎo) RISC切割同源單鏈 mRNA，而且可作為引物與靶 RNA結(jié)合并在 RNA聚合酶 (RNAdependent RNA polymerase， RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA，新合成的 dsRNA再由 Dicer切割產(chǎn)生大量的次級 siRNA，從而使 RNAi的作用進一步放大，最終將靶 mRNA完全降解。 應(yīng)用：構(gòu)建發(fā)卡 RNA干擾構(gòu)件或兩端都有啟動子的小基因片段來實現(xiàn)基因失活 RNAi干擾現(xiàn)象的重要特征 ? RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制； ? RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的 mRNA； ? RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的 dsRNA分子 (數(shù)量遠遠少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量 )就能 完全抑制 相應(yīng)基因的表達，是以催化放大的方式進行的； ? RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點 。 ? dsRNA不得短于 21個堿基，并且長鏈 dsRNA也在細胞內(nèi)被 Dicer酶切割為 21 bp左右的 siRNA，并由 siRNA來介導(dǎo) mRNA切割。而且大于 30 bp的 dsRNA不能在哺乳動物中誘導(dǎo)特異的 RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡； ? ATP依賴性：在去除 ATP的樣品中 RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示 RNA干擾是一個 ATP依賴的過程?？赡苁?Diecer和 RISC的酶切反應(yīng)必須由 ATP提供能量。 （ 4） 核酶 核酶：具有催化作用的 RNA分子，能對單鏈 RNA分子進行特異性切割或連接。 1982年， Cech等研究原生動物四膜蟲 rRNA時，首次發(fā)現(xiàn) rRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 I型內(nèi)含子的剪切及外顯子的拼接過程可在無任何蛋白質(zhì)存在的情況下發(fā)生，證明了 RNA具有催化功能。 1983年 Altman 等人在研究細菌 RNase P時發(fā)現(xiàn)， 它具有兩個組分：一條 RNA鏈（稱為 M1RNA）和一個蛋白質(zhì)（稱為 C5蛋白）。它的功能是剪切 tRNA分子上多余的或前體序列。而在體外 當約 400個核苷酸的 M1RNA單獨存在時，也具有完成切割 tRNA前體的功能， C5起著提高底物與 RNase P親和力的作用 核酶定義及種類 核酶的發(fā)現(xiàn)，從根本上改變了以往只有蛋白質(zhì)才具有催化功能的概念，為此， Cech和 Altman也因此獲得了 1989年的諾貝爾化學(xué)獎。目前主要有四類自體剪切型核酶：錘頭狀核酶，發(fā)夾狀核酶，瓦庫德衛(wèi)星序列核酶（ Varkud satellite）和丁型肝炎病毒核酶（ Hepatitis delta virus ribozyme） 剪接型核酶：為內(nèi)含子，分為 I型（內(nèi)含子不成環(huán)）和 II型（內(nèi)含子成環(huán)） 剪切型核酶：自體剪切型與異體剪切型（ RNaseP） hairpin hepatitis delta virus hammerhead ? 瓦庫德衛(wèi)星序列核酶含 150個以上的核苷酸，是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最大結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的自切型核酶 ? 每一類核酶都有序列保守的催化中心，天然核酶均發(fā)生順式作用進行自裂解。 ? 錘頭狀核酶 的研究最深入、其在基因工程中的應(yīng)用最具潛力。 二級結(jié)構(gòu) 自切型核酶 ?錘頭狀核酶的裂解位點： 5′NUX3′ N為任意堿基， X 是除 G之外的任意堿基，目前發(fā)現(xiàn)的天然核酶中 ，裂解位點 5′GUC3′最為常見。 ?雖然天然核酶只能發(fā)生 順式作用 ，但是可以人工合成核酶序列，進行 反式作用 ，裂解目標基因的 mRNA，達到抑制基因表達的目的。 (破壞環(huán) I) 錘頭狀核酶特點 中心區(qū)（催化）＋反義臂（定位） 反式作用 抑制基因表達效果非常高 一個核酶構(gòu)件可以破壞許多 mRNA 動力學(xué)特征限制了其應(yīng)用的范圍 反義 RNA＋核酶中心區(qū)序列＋反義 RNA ☆ 順式作用 在目標基因的下游區(qū)域（ polyA加尾信號之前）插入一段錘頭核酶序列，轉(zhuǎn)錄后的初級轉(zhuǎn)錄本末端被加入的核酶切斷（自剪切），無法形成 polyA結(jié)構(gòu)， 不穩(wěn)定而降解。 擴展的順式作用 核酶序列和適配體（ aptamer）序列結(jié)合 ，構(gòu)建順式調(diào)控元件。 aptamer定義 : 能與蛋白質(zhì)或代謝物等配體特異和高效結(jié)合的RNA或 DNA片段。通常用體外篩選方法制備得到。天然適配體通常存在于 riboswitch結(jié)構(gòu)中。 Synthetic aptamers are generated through in vitro selection or Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) processes SELEX： 一種從大容量寡核苷酸庫中經(jīng)過反復(fù)的分離、擴增步驟得到對靶分子具有高親和力的特異寡核苷酸片段（ aptamer）的技術(shù)。 ☆ ?合成的調(diào)節(jié)元件可以直接使用 1個或數(shù)個 aptamer，一般插入目標 mRNA的 5‘非翻譯區(qū)（靠近起始密碼子或 5’帽子區(qū)域） ?加入配基分子使 aptamer構(gòu)象變化，對翻譯進行調(diào)節(jié)。 缺點：插入序列在無配基情況下經(jīng)常會影響到翻譯，限制了其推廣應(yīng)用。 天然的 FMN riboswitch中的 FMN aptamer與錘頭核酶序列的組合：體外實驗證明 FMN造成 aptamer構(gòu)象的變化，從而影響核酶活性（ off 系統(tǒng)，無FMN時核酶處于失活構(gòu)象，有 FMN時核酶有活性，剪切 RNA） 該系統(tǒng)破壞了核酶的一個環(huán)，影響到核酶的 3級結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)的效果差 適配體 +核酶：人工順式調(diào)控元件 核酶序列插入 3‘端非翻譯區(qū)，高效抑制基因表達。 設(shè)計序列，使 aptamer和核酶的一個環(huán)連接，不破壞環(huán)結(jié)構(gòu) 篩選： 合成 aptamer+核酶的 RNA序列，其中 aptamer的部分序列為隨機序列。 加入特定代謝物（茶堿），和核酶斷裂反應(yīng)需要的試劑 電泳分離變短的 RNA片段，該片段和代謝物結(jié)合后才有核酶活性 測序，得到 OFF 系統(tǒng)（對于 on系統(tǒng)，分離無代謝物時變短的 RNA片段測序） 其它應(yīng)用： on系統(tǒng)檢測胞內(nèi)代謝物濃度 茶堿 aptamer也可以和其結(jié)構(gòu)類似物咖啡因 、黃嘌呤核苷酸結(jié)合 未來應(yīng)用：針對特定代謝途徑中的代謝物，篩選對應(yīng)的aptamer，人工合成核酶 +aptamer的基因表達調(diào)控元件，實現(xiàn)代謝途徑中基因表達的 動態(tài)優(yōu)化調(diào)節(jié) 。 A B C D F E E1 E2 E3 E4 E5 E6 ON 系統(tǒng) A, E2 B, E3 C, E5 OFF 系統(tǒng) E, E6 D, E4 ☆ 蛋白質(zhì)水平的基因抑制 ? 抗體微量注射 （效果不持續(xù)） ? 抗體的細胞內(nèi)表達 (抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的蛋白效果好） 一般構(gòu)建抗體的一部分肽鏈如 :scFv ☆