12-基因工程ppt-第八章基因工程-資料下載頁
2025-03-09 14:51本頁面
【正文】 真核細胞主動攝取或被動導入外源 DNA片段而獲得新的表型的過程。 目的基因的篩選和鑒定(screening/selection) ? 遺傳學方法 – 插入滅活法 (insertion inactivation):抗藥性標志選擇 – 標志補救 表達產物與營養(yǎng)缺陷互補 * α互補 藍白斑 篩選 ? 免疫學方法 ? 分子雜交 探針 – 原位雜交 ? PCR ? 限制性酶切圖譜 IPTG。Xgal(5 溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 ) bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 克隆基因的表達 ? 載體有轉錄、翻譯的元件； 密碼子通用 ? 原核表達體系 – 原核表達載體的標準 *合適的篩選標志 *強啟動子 *翻譯控制序列 *多克隆位點 ? 融合蛋白（ fusion protein,包涵體） – 表達的蛋白質或多肽的 N末端由原核 DNA編碼， C末斷由克隆的真核 DNA編目。 ? 大腸桿菌表達體系的不足 – 缺乏轉錄后加工機制，只能表達 cDNA – 缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和糖基化 – 融合蛋白形成包涵體，復性后才有活性 – 很難表達大量的可溶性蛋白 真核表達體系 ? 轉染方法 – 磷酸鈣沉淀 – DEAE葡聚糖介導轉染 – 電穿孔 – 脂質體轉染；人造膜 – 顯微注射 ? 篩選標志 tk Neor G418 ? 瞬時轉染 目的基因不整合進宿主基因組 ? 穩(wěn)定轉染 目的基因整合進宿主基因組 tk 細胞突變株篩選轉染細胞 ? 胸苷激酶（ tk） – TTP：從頭合成（氨甲喋呤阻斷），補救合成 – HAT選擇（ H：次黃嘌呤； A：氨甲喋呤；T：胸苷） – tk+：生長 – tk+帶 tk基因的質粒：生長 藥物篩選轉染細胞 ? neor – 新霉素：細菌抗生素，干擾原核生物蛋白質合成 – G418：干擾原核、真核生物 – neo：磷酸轉移酶，使 G418失活 – neo 與目的基因連鎖 ,轉染 目的基因的定點誘變及其應用 ? 基因定點誘變技術 ? 基因定點誘變技術的應用 演講完畢，謝謝觀看！
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