12-基因工程ppt-第八章基因工程-資料下載頁(yè)
2025-03-09 14:51本頁(yè)面
【正文】 真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源 DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。 目的基因的篩選和鑒定(screening/selection) ? 遺傳學(xué)方法 – 插入滅活法 (insertion inactivation):抗藥性標(biāo)志選擇 – 標(biāo)志補(bǔ)救 表達(dá)產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ) * α互補(bǔ) 藍(lán)白斑 篩選 ? 免疫學(xué)方法 ? 分子雜交 探針 – 原位雜交 ? PCR ? 限制性酶切圖譜 IPTG。Xgal(5 溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 ) bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 克隆基因的表達(dá) ? 載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件； 密碼子通用 ? 原核表達(dá)體系 – 原核表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn) *合適的篩選標(biāo)志 *強(qiáng)啟動(dòng)子 *翻譯控制序列 *多克隆位點(diǎn) ? 融合蛋白（ fusion protein,包涵體） – 表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的 N末端由原核 DNA編碼， C末斷由克隆的真核 DNA編目。 ? 大腸桿菌表達(dá)體系的不足 – 缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá) cDNA – 缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和糖基化 – 融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性 – 很難表達(dá)大量的可溶性蛋白 真核表達(dá)體系 ? 轉(zhuǎn)染方法 – 磷酸鈣沉淀 – DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 – 電穿孔 – 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；人造膜 – 顯微注射 ? 篩選標(biāo)志 tk Neor G418 ? 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 目的基因不整合進(jìn)宿主基因組 ? 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 目的基因整合進(jìn)宿主基因組 tk 細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 ? 胸苷激酶（ tk） – TTP：從頭合成（氨甲喋呤阻斷），補(bǔ)救合成 – HAT選擇（ H：次黃嘌呤； A：氨甲喋呤；T：胸苷） – tk+：生長(zhǎng) – tk+帶 tk基因的質(zhì)粒：生長(zhǎng) 藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 ? neor – 新霉素：細(xì)菌抗生素，干擾原核生物蛋白質(zhì)合成 – G418：干擾原核、真核生物 – neo：磷酸轉(zhuǎn)移酶，使 G418失活 – neo 與目的基因連鎖 ,轉(zhuǎn)染 目的基因的定點(diǎn)誘變及其應(yīng)用 ? 基因定點(diǎn)誘變技術(shù) ? 基因定點(diǎn)誘變技術(shù)的應(yīng)用 演講完畢，謝謝觀(guān)看！
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