臨床樣本的采集、運(yùn)輸和保存及核酸提取-資料下載頁
2025-01-05 15:29本頁面
【正文】 滅菌的水和 RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液 ,用干烤過的藥匙稱取試劑 ,將溶液裝入無 RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?,溶液均應(yīng)用 %DEPC于 37℃ 至少處理 12小時 ,然后于 100℃ 加熱 15分鐘或高壓蒸汽滅菌 15分鐘l 須注意的是 ,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ,因此不能用來處理含有 Tris一類的緩沖液 ,因此可存幾瓶新的 ,未開封的 Tris試劑以制備無 RNase的溶液7. RNA提取中 RNase 污染的控制l 實(shí)驗(yàn)操作人員的手是 RNase污染最主要的潛在來源。 l 策略是：l在 準(zhǔn)備用于 RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時 ,以及在涉及 RNA的整個提取操作過程中 ,都應(yīng)戴一次性手套l在 RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套（三）、用于提取 RNA的血樣的處理1. 取新鮮抗凝血 2－ 3ml入 15ml無菌塑料管， 600g離心 5分鐘，棄上清。 2. 加入 6倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液（約 12ml），輕輕吹打混勻，本步驟在室溫或 4度操作均可。裂解時間至 45分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。3. 600g離心 5分鐘，棄紅色上清。 4℃ 離心效果更佳。4. 一般情況下， 裂解 1次紅細(xì)胞應(yīng)該裂解的差不多，如果有較多紅細(xì)胞沒有裂解的話，可以再加點(diǎn)紅細(xì)胞裂解液約 5ml裂解 1次。步驟同 3。5. 向得到的細(xì)胞團(tuán)中加 Trizol ，彈勻，將細(xì)胞團(tuán)打散，轉(zhuǎn)入 ，封好蓋。標(biāo)上號，纏上封口膜，－20 ℃ 或－ 70 ℃ 保存。（四）、 RNA提取的常用方法 l 表面活性劑加蛋白酶 K，氯仿 酚抽提法l 胍鹽提取結(jié)合氯仿 酚抽提法l 胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等RNA提取實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備【使用器具】 盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，則使用%DEPC水溶液在 37℃ 處理 12h，后 120℃ 高壓 30min，去除殘留 DEPC【試劑配制】 無菌水須用 %DEPC處理后高溫高壓滅菌 RNA實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng) RNA提取專用，避免其他試劑交叉污染【其他】 實(shí)驗(yàn)過程中使用一次性手套，并經(jīng)常更換；在 RNA專用區(qū)操作，操作過程中避免交談 … …表面活性劑加蛋白酶 K，氯仿 酚抽提法：1. 每 mg組織中加入 1mlTrizol試劑，高速破碎組織（使用高速組織搗碎器）2. 加入氯仿 ,輕輕顛倒混勻，室溫靜置分層。3. 高速離心 12023rpm， 48 176。C ， 10分鐘4. 吸上清液至新離心管中，約 600ul5. 加入 500ul異丙醇，混勻，室溫靜置 10分鐘6. 高速離心 12023rpm， 48 176。C ， 10分鐘7. 棄上清液，沉淀為 RNA8. 加入 1mlDEPC處理的 75%乙醇，混勻， 7500rpm離心， 48176。C ， 5分鐘9. 加入 DEPC處理水 30ul，混勻， 5560 176。C 水浴10. 3ul加入 297ulDEPC水，測定濃度和純度異硫氰酸胍（ GuSCN）結(jié)合氯仿 酚提取法 試劑的作用：l 加入 β 疏基乙醇、二硫蘇糖醇（ DTT）等還原劑可以還原 RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活（四）、 mRNA的分離純化l 除血紅蛋白及組蛋白的 mRNA外，絕大多數(shù) mRNA在其3180。末端帶有長短不同的 poly（ A）尾巴l 利用堿基配對原則，通過 oligo（ dT） 纖維素或poly（ U） 瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總 RNA制品中分離純化 mRNA謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAI
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