【正文】 于包裝的 cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒 DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。噬菌粒載體： 噬菌粒（ phagemid or phasmid）是由單鏈?zhǔn)删wM13或 f1與質(zhì)粒載體重組而成的新型載體。它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便 DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。四、 YAC載體與 YAC文庫(kù)： YAC（ yeast artificial chromosome，酵母人工染色體）質(zhì)粒載體是在人類基因組計(jì)劃（ HGP）實(shí)施的背景下發(fā)展起來(lái)的一類克隆特大片段的載體。這類載體含有酵母菌的復(fù)制起點(diǎn) ARS（ automatic replication sequence,ARS），著絲粒 CEN（centromere），端粒 TEL（ telomere），以及選擇性標(biāo)記和克隆位點(diǎn)；同時(shí)還含有大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)，可以在大腸桿菌中以環(huán)狀質(zhì)粒的形式存在。DNA體外重組后以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入酵母細(xì)胞。 這類載體克隆能力可達(dá) 1~2Mb。主要用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。原核生物主要載體用途小結(jié) ： 載體用途質(zhì)粒 λ cosmid M13 YAC大片段 DNA克隆 — + + — +基因文庫(kù)構(gòu)建 — + + — + cDNA文庫(kù)構(gòu)建 + + — — —序列分析 + — — + —單鏈探針 — — — + —工程菌 + — — — —五、真核生物載體：? 由于真核生物與原核生物在ＤＮＡ復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)上存在著差異，所以要求用不同的基因載體。 真核生物基因工程載體的要求與原核生物基因工程載體大體相似，所不同的是：?它除了含有真核基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的必要結(jié)構(gòu)外，還必須含有細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的必要結(jié)構(gòu)，以便能在細(xì)菌中大量繁殖。?含有細(xì)菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的雙重選擇性標(biāo)記，這就是所謂的 穿梭質(zhì)粒 ，可在哺乳動(dòng)物和原核生物之間穿梭。 植物基因工程載體： 用于植物基因工程的載體有 Ti質(zhì)粒載體及病毒載體兩類。 Ti質(zhì)粒是存在于根癌農(nóng)桿菌的一種質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，會(huì)在植株的根 —— 莖結(jié)合部產(chǎn)生未分化的細(xì)胞團(tuán)，即冠癭瘤。有意思的是在形成冠癭瘤的同時(shí)，一部分 Ti質(zhì)粒（ T DNA）可以重組到植物染色體中去，這一特性使 Ti質(zhì)粒有希望成為有效的植物基因工程載體，事實(shí)上， Ti質(zhì)粒是迄今研究得最多的植物基因工程載體。 由于 Ti質(zhì)粒的宿主范圍較窄，僅感染某些雙子葉植物，因此人們又發(fā)展了另一類植物基因工程載體 —— 病毒載體。常用的植物病毒載體有以下幾類：?ssRNA病毒：例如煙草脆裂病毒（ TRV），必須先將單鏈 RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈的 cDNA，才可作為載體。?ssDNA病毒：例如雙子痤病毒，這類病毒可感染單子葉植物，所以是很有前途的一類載體。?dsDNA病毒：這是研究得最多的植物病毒載體，例如花椰菜花葉病毒。 哺乳動(dòng)物基因工程載體： 目前使用的哺乳動(dòng)物基因載體大多由哺乳動(dòng)物病毒經(jīng)改造而成。用得比較多的病毒有猴空泡病毒（ SV40）、單純皰疹病毒（ HSV）、 Rous肉瘤病毒、 EB病毒等。 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體必須考慮以下幾個(gè)表達(dá)元件：?啟動(dòng)子與增強(qiáng)子?終止信號(hào)與加尾信號(hào)?剪接識(shí)別信號(hào)?復(fù)制與選擇元件選擇系統(tǒng) ：?HAT選擇系統(tǒng) —— 胸苷激酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ XGPRT）、二氫葉酸還原酶（ DHFR）系統(tǒng)：嘌呤合成：谷氨酰胺 +PRPP IMP AMP GMPFH4 FH2 H XGPRT天冬氨酸 UMPCMPTMP FH4 FH2 TTK7,8二氫葉酸 +NADPH+H+ 5,6,7,8四氫葉酸 +NADP+ DHFR氨甲喋呤抑制選擇原理：? tk基因及 xgprt基因的篩選：受體細(xì)胞必須是相應(yīng)的tk或 xgprtdhfr，將細(xì)胞培養(yǎng)在含 HAT（ H：黃嘌呤，A：氨甲喋呤， T：胸苷）的培養(yǎng)基中。在 A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成 AMP、TMP及 GMP。這三中核苷酸的合成只能有補(bǔ)償途徑合成，必須具有 tk或 xgprt基因的存在細(xì)胞才可生長(zhǎng)。?dhfr基因的篩選：受體細(xì)胞必須是 dhfr ，將細(xì)胞培養(yǎng)在含 HT的培養(yǎng)基中。?新霉素抗性選擇系統(tǒng)： 新霉素是原核生物的抗生素，對(duì)真核生物沒(méi)有抑制作用，但新霉素的類似物 G418對(duì)真核細(xì)胞及原核細(xì)胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（ neo）能在真核細(xì)胞中表達(dá)并能使 G418失活（ neo基因編碼一個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶），細(xì)胞可以生長(zhǎng)。?氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移霉檢測(cè)系統(tǒng)： 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移霉（ CAT）可使氯霉素乙?；セ钚?。當(dāng) cat基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，制備細(xì)胞提取物，然后加入乙酰輔酶 A及 14C標(biāo)記的氯霉素，如果細(xì)胞中存在 cat，可使氯霉素乙?；?，通過(guò)薄層層析將乙?；拔匆阴；穆让顾胤珠_(kāi)，再用放射自顯影檢測(cè)。帶有小鼠乳腺病毒 MMTV的 LTR啟動(dòng)子（ PLTR）， gpt（ xgprt），加尾信號(hào)等帶有 SV40早期啟動(dòng)子（ PE），加尾信號(hào)。原核生物的啟動(dòng)子 T7及 Ptac等。第四節(jié) 重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞一、原核生物的轉(zhuǎn)化（ transfomation）與轉(zhuǎn)染（transfection）?：細(xì)菌細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經(jīng) CaCl2處理，或制備成原生質(zhì)體的情況下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用這一特性可將重組ＤＮＡ導(dǎo)入受體細(xì)胞中，用質(zhì)粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法。 由于 ，因此 的轉(zhuǎn)化一般采用鈣轉(zhuǎn)化法。該方法是將 CaCl2(0℃ ) 致敏，而后在高溫（ 42 ℃ ）下熱休克，這樣可使外原 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。?：在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外原 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。?原核生物的轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染是指轉(zhuǎn)化感染（Transfection來(lái)自于 transfomation與 infection），所以凡是以噬菌體（如 M13）或病毒為載體，以轉(zhuǎn)化的方法將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法均稱為轉(zhuǎn)染。因此轉(zhuǎn)染就方法來(lái)說(shuō)與轉(zhuǎn)化是一樣的。二、體外包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction）： 以 λ噬菌體作為載體，常利用轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。噬菌體載體在體外與目的 DNA片段重組后，與噬菌體的頭部蛋白及尾部蛋白混合保溫，讓 DNA在體外進(jìn)行包裝，產(chǎn)生有感染能力的噬菌體顆粒。利用這種噬菌體感染受體細(xì)胞從而將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。 包裝蛋白的制備可采用單菌株法或雙菌株法。單菌株法是利用 cos突變的溶源菌。雙菌株法則利用兩株不同的突變菌株，如 BHB2688是編碼頭部蛋白的 E基因突變， BHB2690是編碼頭部蛋白的 D基因突變，兩個(gè)菌株經(jīng)誘導(dǎo)后都能合成包裝蛋白，但不能進(jìn)行包裝，當(dāng)兩者的蛋白質(zhì)混合后便具有包裝能力。三、真核生物的轉(zhuǎn)染：?磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)：主要用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由 Na2HPO4和 NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將 DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。?電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣，主要用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。?基因搶轉(zhuǎn)染法：主要用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。利用被電場(chǎng)或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。?激光微束穿孔法：主要用于葉綠體或線粒體的基因工程操作。利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進(jìn)入細(xì)胞。?顯微注射法：主要用于動(dòng)物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體，利用毛細(xì)管直接將 DNA注入細(xì)胞內(nèi)。?脂質(zhì)體（ liposome）介導(dǎo)法：主要用于動(dòng)物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體。將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過(guò)脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。?多聚物介導(dǎo)法：用于動(dòng)物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體。利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價(jià)陽(yáng)離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過(guò)細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第五節(jié) 克隆子的篩選與鑒定一、克隆子的篩選：利用載體的選擇性標(biāo)記進(jìn)行篩選。二、克隆子的鑒定：?遺傳檢測(cè)法：該方法要求克隆基因能夠表達(dá)，并利用相應(yīng)的基因突變型作為受體細(xì)胞，當(dāng)受體細(xì)胞由突變型變?yōu)橐吧蜁r(shí)或賦予受體細(xì)胞特定的表型時(shí)，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因。優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果較可靠。缺點(diǎn)： 基因必須表達(dá)并具有合適的受體細(xì)胞。?凝膠電泳檢測(cè)法：該方法利用凝膠電泳的方法檢測(cè)重組 DNA分子或克隆片段的大小（分子量）。優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)便、快速。缺點(diǎn)： 只能提供克隆片段大小的信息。?免疫化學(xué)檢測(cè)法：利用免疫學(xué)的原理，檢測(cè)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法 ：該方法類似于原位雜交法。優(yōu)點(diǎn) ：方法簡(jiǎn)便，一次可檢測(cè)大量的克隆子。缺點(diǎn) ：克隆基因必須表達(dá)并具有相應(yīng)的抗體。放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法的原理濾膜培養(yǎng)皿及菌落抗體溶液放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法的操作程序ELISA檢測(cè)技術(shù) ： ELISA（ enzyme linked immunosorbent assay）是一種固相免疫檢測(cè)技術(shù)。比較常用的方法有用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法和用于檢測(cè)抗體的間接法兩種。因此，基因工程中用于檢測(cè)克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的方法主要是雙抗體夾心法。優(yōu)點(diǎn)：能進(jìn)行定量檢測(cè)，因此該方法更多地用于基因表達(dá)產(chǎn)物的定量分析。缺點(diǎn)：較繁瑣?；虮仨毐磉_(dá)。?分子雜交技術(shù)檢測(cè)法：包括菌落或噬菌斑的原位雜交技術(shù)。優(yōu)點(diǎn) ：方法簡(jiǎn)便、快速。缺點(diǎn) ：必須具有相應(yīng)的探針。?雜交抑制翻譯法：該方法用于 cDNA文庫(kù)中目的基因的篩選。其原理是利用 cDNA與 mRNA雜交后導(dǎo)致 mRNA的不能翻譯，從而篩選陽(yáng)性克隆子。優(yōu)點(diǎn) ：不需要克隆基因的表達(dá)，不需要探針或抗體。缺點(diǎn) ：較煩瑣。?DNA序列分析：該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。各克隆子提取相應(yīng)的 cDNA從 cDNA文庫(kù)響應(yīng)的細(xì)胞提出 mRNA 混合雜交無(wú)細(xì)胞翻譯體系（麥胚或網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物）體外翻譯 35S甲硫氨酸標(biāo)記 聚丙烯酰胺凝膠電泳 放射自顯影分析比較，找出目的蛋白不合成的克隆子即為目的基因第六節(jié) 文庫(kù)的構(gòu)建一、 cDNA文庫(kù)（ library）的構(gòu)建 cDNA文庫(kù)是指得到足夠多的分別克隆的 cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種 mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的 cDNA文庫(kù)。 為了得到特定基因的 cDNA片段，就需要先分離出有功能的特定 mRNA。所以首先必須考慮從什么細(xì)胞，用什么方法將ｍＲＮＡ提取出來(lái)。這是由于不同細(xì)胞可限定合成不同的蛋白質(zhì)，這樣在一些組織細(xì)胞中除了含有普通蛋白質(zhì)的 mRNA外，還會(huì)有數(shù)量較多的特定 mRNA。 mRNA的分離有許多種方法，例如化學(xué)的方法，物理的方法（如差速梯度離心法）等。有的還可以利用真核生物的 mRNA具有的 poly A尾巴進(jìn)行親和層析法分離 mRNA。有的則采用幾種方法聯(lián)合使用，其總的目標(biāo)就是獲得純度高、得率高的有活性的 mRNA。? 在取得專性的 mRNA后，接下來(lái)就是將 mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成雜種 DNA鏈（ DNARNA分子），在堿（ KOH）作用下水解 RNA鏈，然后經(jīng) DNA聚合酶作用再合成第二條 DNA鏈，即形成雙鏈cDNA分子，將雙鏈 cDNA插入載體后形成重組體，并導(dǎo)入細(xì)菌中，隨細(xì)菌的繁殖而擴(kuò)增和克隆，形成 cDNA文庫(kù) 二、基因組文庫(kù)的構(gòu)建 基因文庫(kù)（ gene library）：用重組 DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總 DNA或染色體 DNA的所有片段隨機(jī)地連接在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過(guò)細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因