【正文】 于包裝的 cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒 DNA的形式存在于細胞內(nèi)。噬菌粒載體： 噬菌粒（ phagemid or phasmid）是由單鏈噬菌體M13或 f1與質(zhì)粒載體重組而成的新型載體。它具有質(zhì)粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便 DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。四、 YAC載體與 YAC文庫： YAC（ yeast artificial chromosome，酵母人工染色體）質(zhì)粒載體是在人類基因組計劃（ HGP）實施的背景下發(fā)展起來的一類克隆特大片段的載體。這類載體含有酵母菌的復制起點 ARS（ automatic replication sequence,ARS），著絲粒 CEN（centromere），端粒 TEL（ telomere），以及選擇性標記和克隆位點；同時還含有大腸桿菌的復制起始點，可以在大腸桿菌中以環(huán)狀質(zhì)粒的形式存在。DNA體外重組后以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式導入酵母細胞。 這類載體克隆能力可達 1~2Mb。主要用于基因組文庫的構(gòu)建。原核生物主要載體用途小結(jié) ： 載體用途質(zhì)粒 λ cosmid M13 YAC大片段 DNA克隆 — + + — +基因文庫構(gòu)建 — + + — + cDNA文庫構(gòu)建 + + — — —序列分析 + — — + —單鏈探針 — — — + —工程菌 + — — — —五、真核生物載體：? 由于真核生物與原核生物在ＤＮＡ復制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)上存在著差異，所以要求用不同的基因載體。 真核生物基因工程載體的要求與原核生物基因工程載體大體相似，所不同的是：?它除了含有真核基因的轉(zhuǎn)錄和復制的必要結(jié)構(gòu)外，還必須含有細菌的轉(zhuǎn)錄和復制的必要結(jié)構(gòu)，以便能在細菌中大量繁殖。?含有細菌及哺乳動物細胞中的雙重選擇性標記，這就是所謂的 穿梭質(zhì)粒 ，可在哺乳動物和原核生物之間穿梭。 植物基因工程載體： 用于植物基因工程的載體有 Ti質(zhì)粒載體及病毒載體兩類。 Ti質(zhì)粒是存在于根癌農(nóng)桿菌的一種質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌感染植物時，會在植株的根 —— 莖結(jié)合部產(chǎn)生未分化的細胞團，即冠癭瘤。有意思的是在形成冠癭瘤的同時，一部分 Ti質(zhì)粒（ T DNA）可以重組到植物染色體中去，這一特性使 Ti質(zhì)粒有希望成為有效的植物基因工程載體，事實上， Ti質(zhì)粒是迄今研究得最多的植物基因工程載體。 由于 Ti質(zhì)粒的宿主范圍較窄，僅感染某些雙子葉植物，因此人們又發(fā)展了另一類植物基因工程載體 —— 病毒載體。常用的植物病毒載體有以下幾類：?ssRNA病毒：例如煙草脆裂病毒（ TRV），必須先將單鏈 RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈的 cDNA，才可作為載體。?ssDNA病毒：例如雙子痤病毒，這類病毒可感染單子葉植物，所以是很有前途的一類載體。?dsDNA病毒：這是研究得最多的植物病毒載體，例如花椰菜花葉病毒。 哺乳動物基因工程載體： 目前使用的哺乳動物基因載體大多由哺乳動物病毒經(jīng)改造而成。用得比較多的病毒有猴空泡病毒（ SV40）、單純皰疹病毒（ HSV）、 Rous肉瘤病毒、 EB病毒等。 在哺乳動物細胞內(nèi)表達的載體必須考慮以下幾個表達元件：?啟動子與增強子?終止信號與加尾信號?剪接識別信號?復制與選擇元件選擇系統(tǒng) ：?HAT選擇系統(tǒng) —— 胸苷激酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ XGPRT）、二氫葉酸還原酶（ DHFR）系統(tǒng)：嘌呤合成：谷氨酰胺 +PRPP IMP AMP GMPFH4 FH2 H XGPRT天冬氨酸 UMPCMPTMP FH4 FH2 TTK7,8二氫葉酸 +NADPH+H+ 5,6,7,8四氫葉酸 +NADP+ DHFR氨甲喋呤抑制選擇原理：? tk基因及 xgprt基因的篩選：受體細胞必須是相應的tk或 xgprtdhfr，將細胞培養(yǎng)在含 HAT（ H：黃嘌呤，A：氨甲喋呤， T：胸苷）的培養(yǎng)基中。在 A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成 AMP、TMP及 GMP。這三中核苷酸的合成只能有補償途徑合成，必須具有 tk或 xgprt基因的存在細胞才可生長。?dhfr基因的篩選：受體細胞必須是 dhfr ，將細胞培養(yǎng)在含 HT的培養(yǎng)基中。?新霉素抗性選擇系統(tǒng)： 新霉素是原核生物的抗生素，對真核生物沒有抑制作用，但新霉素的類似物 G418對真核細胞及原核細胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（ neo）能在真核細胞中表達并能使 G418失活（ neo基因編碼一個磷酸轉(zhuǎn)移酶），細胞可以生長。?氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移霉檢測系統(tǒng)： 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移霉（ CAT）可使氯霉素乙酰化而失去活性。當 cat基因在真核細胞內(nèi)表達后，制備細胞提取物，然后加入乙酰輔酶 A及 14C標記的氯霉素，如果細胞中存在 cat，可使氯霉素乙?；?，通過薄層層析將乙酰化及未乙?；穆让顾胤珠_，再用放射自顯影檢測。帶有小鼠乳腺病毒 MMTV的 LTR啟動子（ PLTR）， gpt（ xgprt），加尾信號等帶有 SV40早期啟動子（ PE），加尾信號。原核生物的啟動子 T7及 Ptac等。第四節(jié) 重組 DNA導入受體細胞一、原核生物的轉(zhuǎn)化（ transfomation）與轉(zhuǎn)染（transfection）?：細菌細胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經(jīng) CaCl2處理，或制備成原生質(zhì)體的情況下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用這一特性可將重組ＤＮＡ導入受體細胞中，用質(zhì)粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法。 由于 ，因此 的轉(zhuǎn)化一般采用鈣轉(zhuǎn)化法。該方法是將 CaCl2(0℃ ) 致敏，而后在高溫（ 42 ℃ ）下熱休克，這樣可使外原 DNA進入受體細胞。?：在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外原 DNA進入受體細胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。?原核生物的轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染是指轉(zhuǎn)化感染（Transfection來自于 transfomation與 infection），所以凡是以噬菌體（如 M13）或病毒為載體，以轉(zhuǎn)化的方法將 DNA導入細胞的方法均稱為轉(zhuǎn)染。因此轉(zhuǎn)染就方法來說與轉(zhuǎn)化是一樣的。二、體外包裝與轉(zhuǎn)導（ transduction）： 以 λ噬菌體作為載體，常利用轉(zhuǎn)導的方法將重組DNA導入受體細胞。噬菌體載體在體外與目的 DNA片段重組后，與噬菌體的頭部蛋白及尾部蛋白混合保溫，讓 DNA在體外進行包裝，產(chǎn)生有感染能力的噬菌體顆粒。利用這種噬菌體感染受體細胞從而將重組 DNA導入受體細胞內(nèi)。 包裝蛋白的制備可采用單菌株法或雙菌株法。單菌株法是利用 cos突變的溶源菌。雙菌株法則利用兩株不同的突變菌株，如 BHB2688是編碼頭部蛋白的 E基因突變， BHB2690是編碼頭部蛋白的 D基因突變，兩個菌株經(jīng)誘導后都能合成包裝蛋白，但不能進行包裝，當兩者的蛋白質(zhì)混合后便具有包裝能力。三、真核生物的轉(zhuǎn)染：?磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術：主要用于動物細胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在強烈震蕩下加入由 Na2HPO4和 NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將 DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細胞中，利用細胞的胞飲作用將DNA導入到細胞中。磷酸鈣一方面可以增加細胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細胞內(nèi)的核酸酶水解。?電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣，主要用于植物細胞的轉(zhuǎn)染。?基因搶轉(zhuǎn)染法：主要用于植物細胞的轉(zhuǎn)染。利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內(nèi)的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進入細胞內(nèi)。?激光微束穿孔法：主要用于葉綠體或線粒體的基因工程操作。利用直徑很小、能量很高的激光束在細胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進入細胞。?顯微注射法：主要用于動物細胞或植物的原生質(zhì)體，利用毛細管直接將 DNA注入細胞內(nèi)。?脂質(zhì)體（ liposome）介導法：主要用于動物細胞或植物的原生質(zhì)體。將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合而將 DNA導入細胞內(nèi)。?多聚物介導法：用于動物細胞或植物的原生質(zhì)體。利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過細胞的胞飲作用而進入細胞內(nèi)。第五節(jié) 克隆子的篩選與鑒定一、克隆子的篩選：利用載體的選擇性標記進行篩選。二、克隆子的鑒定：?遺傳檢測法：該方法要求克隆基因能夠表達，并利用相應的基因突變型作為受體細胞，當受體細胞由突變型變?yōu)橐吧蜁r或賦予受體細胞特定的表型時，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因。優(yōu)點： 簡便、快速，結(jié)果較可靠。缺點： 基因必須表達并具有合適的受體細胞。?凝膠電泳檢測法：該方法利用凝膠電泳的方法檢測重組 DNA分子或克隆片段的大?。ǚ肿恿浚?。優(yōu)點： 簡便、快速。缺點： 只能提供克隆片段大小的信息。?免疫化學檢測法：利用免疫學的原理，檢測克隆基因的表達產(chǎn)物。放射性標記抗體檢測法 ：該方法類似于原位雜交法。優(yōu)點 ：方法簡便，一次可檢測大量的克隆子。缺點 ：克隆基因必須表達并具有相應的抗體。放射性標記抗體檢測法的原理濾膜培養(yǎng)皿及菌落抗體溶液放射性標記抗體檢測法的操作程序ELISA檢測技術 ： ELISA（ enzyme linked immunosorbent assay）是一種固相免疫檢測技術。比較常用的方法有用于檢測抗原的雙抗體夾心法和用于檢測抗體的間接法兩種。因此，基因工程中用于檢測克隆基因表達產(chǎn)物的方法主要是雙抗體夾心法。優(yōu)點：能進行定量檢測，因此該方法更多地用于基因表達產(chǎn)物的定量分析。缺點：較繁瑣?；虮仨毐磉_。?分子雜交技術檢測法：包括菌落或噬菌斑的原位雜交技術。優(yōu)點 ：方法簡便、快速。缺點 ：必須具有相應的探針。?雜交抑制翻譯法：該方法用于 cDNA文庫中目的基因的篩選。其原理是利用 cDNA與 mRNA雜交后導致 mRNA的不能翻譯，從而篩選陽性克隆子。優(yōu)點 ：不需要克隆基因的表達，不需要探針或抗體。缺點 ：較煩瑣。?DNA序列分析：該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。各克隆子提取相應的 cDNA從 cDNA文庫響應的細胞提出 mRNA 混合雜交無細胞翻譯體系（麥胚或網(wǎng)織紅細胞提取物）體外翻譯 35S甲硫氨酸標記 聚丙烯酰胺凝膠電泳 放射自顯影分析比較，找出目的蛋白不合成的克隆子即為目的基因第六節(jié) 文庫的構(gòu)建一、 cDNA文庫（ library）的構(gòu)建 cDNA文庫是指得到足夠多的分別克隆的 cDNA片段，匯集這些克隆應包含某種細胞中各種 mRNA的相應順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細胞的 cDNA文庫。 為了得到特定基因的 cDNA片段，就需要先分離出有功能的特定 mRNA。所以首先必須考慮從什么細胞，用什么方法將ｍＲＮＡ提取出來。這是由于不同細胞可限定合成不同的蛋白質(zhì)，這樣在一些組織細胞中除了含有普通蛋白質(zhì)的 mRNA外，還會有數(shù)量較多的特定 mRNA。 mRNA的分離有許多種方法，例如化學的方法，物理的方法（如差速梯度離心法）等。有的還可以利用真核生物的 mRNA具有的 poly A尾巴進行親和層析法分離 mRNA。有的則采用幾種方法聯(lián)合使用，其總的目標就是獲得純度高、得率高的有活性的 mRNA。? 在取得專性的 mRNA后，接下來就是將 mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶合成雜種 DNA鏈（ DNARNA分子），在堿（ KOH）作用下水解 RNA鏈，然后經(jīng) DNA聚合酶作用再合成第二條 DNA鏈，即形成雙鏈cDNA分子，將雙鏈 cDNA插入載體后形成重組體，并導入細菌中，隨細菌的繁殖而擴增和克隆，形成 cDNA文庫 二、基因組文庫的構(gòu)建 基因文庫（ gene library）：用重組 DNA技術將某種生物細胞的總 DNA或染色體 DNA的所有片段隨機地連接在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當?shù)乃拗骷毎型ㄟ^細胞增殖而構(gòu)成各個片段的克隆。當制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因