【正文】 ? （ 3）使用表達(dá)誘導(dǎo)劑 表達(dá)方式 ? （ 1）融合蛋白表達(dá)方式 ? （ 2）非融合蛋白表達(dá)方式 ? （ 3）分泌蛋白表達(dá)方式 （ 1）融合蛋白表達(dá)方式 ? A：融合蛋白的定義 ? B：融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn) ? C：融合蛋白表達(dá)方式的改進(jìn)措施 ? D：融合蛋白的具體表達(dá)方式 A：融合蛋白的定義 ? 融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而另一端（羧基端）則由真核基因編碼。 ? 最終表達(dá)出來的蛋白質(zhì) =1條原核多肽 +1條真核多肽，因此稱為融合蛋白。 B：融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn) ? 融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)點(diǎn) 基因操作簡便、蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)較為穩(wěn)定，不會(huì)被細(xì)菌酶所降解，容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。 ? 融合蛋白表達(dá)方式的缺點(diǎn) 由于融合蛋白中含有原核多肽，帶有細(xì)菌蛋白質(zhì)的抗原性，不能直接用作人體注射劑。 C：融合蛋白表達(dá)方式的改進(jìn)措施 ? （ 1）在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子 X、膠原酶、腸激肽酶）對(duì)融合蛋白進(jìn)行降解。 ? （ 2）用化學(xué)物質(zhì)（ CNBr）進(jìn)行蛋白質(zhì)水解，形成原核多肽 +真核蛋白質(zhì)分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。 D：融合蛋白的具體表達(dá)方式 ? 融合基因 融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核結(jié)構(gòu)基因片段 — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” 關(guān)鍵： ?受體蛋白與外源蛋白的閱讀框要對(duì)齊 ?兩個(gè)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)很重要，應(yīng)便于下一步切除受體蛋白的操作。 融合表達(dá)載體的構(gòu)建 常用的受體蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)） 受體蛋白的切除方法 ?化學(xué)斷裂法：溴化氰（ CNBr） MetAA ?酶促斷裂法：凝血因子 Xa，有蛋白酶活性，識(shí)別序列 :Ile－ Glu－ Gly－ Arg－ AA （ 2）非融合蛋白表達(dá)方式 ? A：非融合蛋白表達(dá)方式的定義 ? B：非融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn) ? C：非融合蛋白的具體表達(dá)方式 A：非融合蛋白表達(dá)方式的定義 ? 非融合蛋白表達(dá)方式是指蛋白質(zhì)的表達(dá)是以真核 mRNA的起始密碼子開始，其結(jié)果使得蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸端不帶任何細(xì)菌性的多肽序列。 ? 非融合蛋白表達(dá)方式也稱為 包涵體型外源蛋白的表達(dá)。大腸桿菌能積累某些特殊生物大分子，使之致密的聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成一種水不溶性的結(jié)構(gòu)。當(dāng)外源蛋白大量表達(dá)時(shí)，這些非天然的蛋白質(zhì)往往容易形成包涵體。 B：非融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn) ? 非融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)點(diǎn) 能夠產(chǎn)生天然的真核蛋白質(zhì)。產(chǎn)物容易回收，包涵體的密度大于細(xì)胞碎片，破碎細(xì)胞后離心即可獲得外源蛋白。 ? 非融合蛋白表達(dá)方式的缺點(diǎn) 蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。產(chǎn)物喪失生物活性，需要經(jīng)過復(fù)性，即使蛋白質(zhì)重新折疊。 C：非融合蛋白的具體表達(dá)方式 ? 非融合蛋白表達(dá)方式可分為 2種： （ a）非融合基因 — 非融合蛋白 （ b）融合基因 — 非融合蛋白 （ a）非融合基因 — 非融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 —ATG— 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” ? 要求 1： SD序列和 ATG之間的距離要合適，相差 23個(gè)堿基，其表達(dá)效率就大受影響。 ? 要求 2： ATG和真核結(jié)構(gòu)基因序列之間必須加接人工接頭，以保證 ATG之后的真核基因不發(fā)生通讀框架的改變。 （ b）融合基因 — 非融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核 ATG— TGATG（真核基因起始結(jié)構(gòu)） — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” ? 這一方式能夠提高表達(dá)效率。 （ 3）分泌蛋白表達(dá)方式 ? A：分泌蛋白表達(dá)的原理 ? B：分泌蛋白表達(dá)常用的信號(hào)肽 A：分泌蛋白表達(dá)的原理 ? 如果把真核 DNA結(jié)合到一個(gè)細(xì)菌信號(hào)肽基因上，其結(jié)果，細(xì)菌信號(hào)肽就能引導(dǎo)真核蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞膜有外面，這樣一來，對(duì)于蛋白質(zhì)的分離和提純都相當(dāng)有利。 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核結(jié)構(gòu)基因片段 — 細(xì)菌信號(hào)肽基因 — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子”。 分泌蛋白表達(dá)的原理圖示 B：分泌蛋白表達(dá)常用的信號(hào)肽 ? 堿性磷酸酶信號(hào)肽（ phoA） ? 膜外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽（ OmpA） ? 霍亂弧菌毒素 B亞單位信號(hào)肽（ CTXB） 關(guān)于基因表達(dá)的總結(jié) ? 總而言之，一種功能蛋白質(zhì)的合成，取決于“該基因的轉(zhuǎn)錄 +mRNA的有效轉(zhuǎn)譯+蛋白質(zhì)的加工”等各個(gè)環(huán)節(jié)。在這些過程中，只要有某一個(gè)細(xì)節(jié)不正確，該基因就不能實(shí)現(xiàn)有效的表達(dá)！ ? 目前，真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平還不夠理想?。? 第四節(jié)：原生質(zhì)體融合技術(shù) 原生質(zhì)體融合技術(shù)共分為 5步，步驟如下： 1：選出二個(gè)帶有標(biāo)記的親株。 2：二個(gè)親株分別制備原生質(zhì)體。 3：二種原生質(zhì)體進(jìn)行融合。 4：細(xì)胞壁的再生 5：融合子的選擇 原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合技術(shù)圖示 1：選出二個(gè)帶有標(biāo)記的親株 ? 親株要求性能穩(wěn)定。 ? 親株應(yīng)該帶有標(biāo)記 ? 常用的標(biāo)記物有： （ 1）營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 （ 2）抗藥性標(biāo)記 （ 3）溫度敏感型標(biāo)記 （ 4）呼吸缺陷型標(biāo)記 （ 5）色素標(biāo)記 2：二個(gè)親株分別制備原生質(zhì)體 ? 二親本分別用酶處理，使得細(xì)胞壁被消化。原生質(zhì)體從細(xì)胞壁中逸出。 ? 為了防止原生質(zhì)體的破裂，應(yīng)將原生質(zhì)體釋放到高滲緩沖液、或者高滲培養(yǎng)液中。 ? 不同的微生物，原生質(zhì)體的制備方法也各不相同。 ? （ 1）革蘭氏陽性細(xì)菌 ? （ 2）革蘭氏陰性細(xì)菌 ? （ 3）鏈霉菌 ? （ 4）酵母菌 ? （ 5）霉菌 （ 1）革蘭氏陽性細(xì)菌 ? 枯草桿菌、芽孢桿菌 可用單一的溶菌酶消化。 ? 黃色短桿菌 溶菌酶消化 + /ml的青霉素 G、振蕩培養(yǎng) 。 （ 2）革蘭氏陰性細(xì)菌 ? 革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁除了肽聚糖外，還含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核聚糖等成份，單一的溶菌酶不能完全消化。 ? （ 1）采用 EDTA+溶菌酶、或者 EDTA+溶菌酶 +甘氨酸進(jìn)行消化 ? （ 2）也可采用含有青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，也能獲得無細(xì)胞壁的原生質(zhì)體。 （ 3）鏈霉菌 ? 鏈霉菌是由不同菌齡有菌絲所構(gòu)成，其原生質(zhì)體制備更加復(fù)雜。 ? 可以采用含 — %甘氨酸的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，效果較好。 （ 4）酵母菌 ? 將酵母菌株接種于 %巰基乙醇+，培養(yǎng)后的菌體易于制備原生質(zhì)體。 （ 5）霉菌 ? 霉菌屬于絲狀真菌，其原生質(zhì)體的制備方法各不相同。 ? 必要時(shí)請(qǐng)參閱相關(guān)專著。 3：二種原生質(zhì)體進(jìn)行融合 ? （ 1）病毒介導(dǎo)法 ? （ 2）聚乙二醇 (PEG)法 ? （ 3） 電融合法 （ 1）病毒介導(dǎo)法 原理 利用病毒表面蛋白同時(shí)與兩個(gè)細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。 如：仙臺(tái)病毒 （ 2）聚乙二醇 (PEG)法 ? 二種原生質(zhì)體等量混合之后，加入聚乙二醇（ PEG）進(jìn)行融合。所使用的 PEG分子量要求為 100012023。再加入 Ca、 Mg。 ? 最終濃度要求： PEG3040% MgCl220mmol CaCl250mmol PH= ? 為了提高融合頻度，同時(shí)可采用電誘導(dǎo)融合法、紫外線照射融合法。 聚乙二醇法的步驟圖示 ? 融合液：含山梨醇或甘露醇， Ca2＋ ，K＋ 。 ? 誘導(dǎo)液：融合液＋20％－ 45％ PEG ? 稀釋液：含葡萄糖，NaOH，甘氨酸等。 （ 3） 電融合法 ? 原理： 在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面電荷發(fā)生改變，從而使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接閉合形成融合體。 電融合儀 4：細(xì)胞壁的再生 ? 二個(gè)原生質(zhì)體融合之后，必須涂布于再生培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞壁的再生。 ? 再生培養(yǎng)基采用高滲培養(yǎng)基。 ? 再生率通常為百分之幾到百分之十幾。 ? 再生后的菌落，可在斜面培養(yǎng)基上作劃線培養(yǎng)。 5：融合子的選擇 ? 主要通過遺傳性標(biāo)記進(jìn)行篩選。 ? 融合子的性能各不相同， （ 1）真正的融合子，其特性較為穩(wěn)定。 （ 2）有一些暫時(shí)性的融合子，時(shí)間一久就會(huì)分離成親本類型。 親本細(xì)胞 同核體 異核體 多核體 異胞質(zhì)體 核質(zhì)體 （ 1）融合細(xì)胞的類型 融合細(xì)胞的篩選機(jī)制 外觀選擇 熒光標(biāo)記選擇 融合細(xì)胞的互補(bǔ)選擇技術(shù) 遺傳互補(bǔ)篩選法 抗性互補(bǔ)篩選法 營養(yǎng)互補(bǔ)篩選法 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. 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