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2025-09-11 18:25本頁面
【正文】 SCSCSC S c l o n i n g si t e三種表達型載體結(jié)構(gòu)圖 Vectors Plasmids Easy to use and store. Rebinant plasmids readily selected with antibiotics. Lambda phage Useful for cloning large (1520Kb fragments). Cosmids Combined plasmid/phage vector permits cloning of even larger ()DNA fragments. Yeast plasmids Permit direct studies on eukaryotic gene regulation. Plant plasmids Bacterial(Agrobacterium)infection of plant transfers Ti plasmid into host plant cells. Type of Vector Advantage 四、常用質(zhì)粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 Vectors pBR322載體 優(yōu)點： 分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。 具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積 10003000個拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。 pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b) Vectors 利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程 BamHI片段 (Tcr) pBR322 PstI(Apr)片段 重組分子 I 重組分子 Ⅱ (Aps Tcr) (Apr Tcs） PstI片段 外源 DNA BamHI片段 重組分子 I 涂布 Ap平板 Apr轉(zhuǎn)化子 分別轉(zhuǎn)化 (ApS TcS) 重組分子 Ⅱ 涂布 Tc平板 Tcr轉(zhuǎn)化 子 影印到 Tc平板上 Apr TcS為重組 子 Apr Tcr為原載體 影印到 Ap平板上 ApS Tcr為重組子 即為非重組 子 篩選重組子的示意圖 重組D N AA m prTcs提取D N A 電泳A m prA m prA m prA m prTcrTcrTcA m prTcsTcs轉(zhuǎn)化 無菌落陽性菌落篩選重組子2 ) D N A 重組無D N A 插入有D N A 插入外源D N A1 ) 限制酶切 pUC18和 pUC19 pUC系列質(zhì)粒載體具有三個顯著特點： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素擴增，每個細胞含 500700個拷貝）。 （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標記基因 LacZα ，可利用 ?互補原理進行藍白篩選。 （ 3）、多克隆位點區(qū)（ MCS） 由人工合成的多個單一酶切位點構(gòu)成。每一種限制性內(nèi)切酶會產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源 DNA上產(chǎn)生相同的末端，進行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到 M13mp載體，進行 DNA測序和體外突變等研究。 Vectors pUC18和 pUC19載體 E c o S ac Kp n S m a B am X b a S al P s t S p h Hi nRI I I I HI I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9Hi n S p h P s t S al Xba B am S m a K p n S ac E c od I I I I I I I HI I I I RIApO r iL a c Z( 8kb )r利用菌落顏色篩選重組子 AprAprApr轉(zhuǎn)化篩選重組子 白色菌落2 ) D N A 重組無D N A 插入有D N A 插入外源D N A重組D N A提取D N A 電泳AprAprApr1)限制 酶切 Cloning Strategies for Identifying Specific Genes 過 程 優(yōu) 點 缺 點 直接分離法（鳥槍法） 操作 簡便 工作量大，有盲目性，目的基因含有不表達的內(nèi)含子 人工合成法 反轉(zhuǎn)錄法 專一性強，目的基因中不含內(nèi)含子 操作過程麻煩 。mRNA生存時間短 ， 技術(shù)要求高 由氨基酸序列合成 據(jù)推測出的核苷酸序列，通過化學(xué)方法合成 專一性最強 ，目的基因不含內(nèi)含子 ，可合成自然界不存在的基因 目前 ， 復(fù)雜的尚不知核苷酸序列的基因不能合成 供體細胞中 DNA 限制性酶 運載體 DNA片段 不同受體細胞 DNA片段擴增 找出 目的基因細胞 目的基因 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 單鏈 DNA 合成 雙鏈 DNA 獲取目的基因的方法 重組 DNA操作過程示意圖 Cloning Strategies for Identifying Specific Gene
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