哺乳動(dòng)物基因工程ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-09-11 18:23本頁(yè)面
【正文】 5 mM MTX mM MTX 培養(yǎng) 單克隆 外源基因擴(kuò)增至 100拷貝 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 GSMSX高效表達(dá)系統(tǒng) 谷氨酰胺合成酶（ GS） 能解除甲硫氨酸亞砜（ MSX） 對(duì)動(dòng)物細(xì) 胞的毒害作用。先將帶有 GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì) 中不必使用 GS缺陷型的 受體細(xì)胞 ，而且在正常的 MSX濃度下就能篩 選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是 GSMSX系統(tǒng)比 DHFR 胞中，由于只有多拷貝的 GS編碼基因才能抗 MSX， 所以在轉(zhuǎn)染過(guò)程 MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因 在載體上安裝病毒或細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)啟 Ap r M13 ori ColE1 ori CMVP Polylinker Gene Intron SV40 T PolyA signal 高效表達(dá)載體 mRNA前體 AAAAAAAAA mRNA 動(dòng)子以及有效的翻譯元件，也是使外源基 因高效表達(dá)的一種手段，如： 細(xì)胞巨化病毒 CMV的啟動(dòng)子 動(dòng)物珠蛋白基因的內(nèi)含子 SV40的終止子和 polyA化信號(hào)序列 絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)型載體 上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)?mRNA前體的剪 切能促進(jìn)成熟 mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利 于翻譯。有的還含有各種信號(hào)肽序列。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白 迄今為止，已有大約 300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但 在哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種： b 干擾素 g 干擾素 凝血因子 VIII 凝血因子 IX 促紅細(xì)胞生成素（ EPO） 生長(zhǎng)因子（ hGH） 白介素 2（ IL2） 乙型肝炎表面抗原 單克隆抗體 CD4受體 組織型纖溶酶原激活劑（ tPA） 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體 大多數(shù)惡性淋巴 Neor 鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子 b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 抗體輕鏈 cDNA b 肌動(dòng)蛋白終止子 pL dhfr SV40啟動(dòng)子 b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 抗體重鏈 cDNA b 肌動(dòng)蛋白終止子 pH 瘤細(xì)胞表面上都 有一種特異性的 糖蛋白 campath 用人源化的小鼠 抗 campath抗體 治療非霍金淋巴 細(xì)胞瘤患者，效 果良好。重組抗 體采用 DHFRM TX系統(tǒng)表達(dá)。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑 第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物 dhfr 啟動(dòng)子 人 tPA cDNA 終止子 細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白 是治療急性心肌梗塞的溶血 栓藥物：人組織纖溶酶原激 活劑（ tPA）。 同樣采用 DHFRMTX系統(tǒng)表達(dá)，受體 細(xì)胞選用 CHO系統(tǒng)。目前， 用該工藝路線生產(chǎn)的重組人 tPA已經(jīng)商品化。 信號(hào)肽編碼序列 此外，人 tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子 VIII 凝血因子 VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來(lái)，血友病 病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子 VIII生物制品進(jìn)行治療，然 而由于人的血源污染乙肝病毒或愛(ài)滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制 品的血友病人慘遭感染，其中 10%的病人最終死于愛(ài)滋病而非血友病。 早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子 VIII的 cDNA便已被克隆和鑒 定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)該藥物的進(jìn)程。與tPA 相似，人凝血因子 VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過(guò)重組哺乳 動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子 VIII尚不能滿足幾代 血友病人的大量需求。
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