【正文】 無抗生素培養(yǎng)液 2ml,將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 102 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 如果培養(yǎng)物受細(xì)菌污染， 24小時(shí)內(nèi)可以獲得陽性結(jié)果。當(dāng)污染的細(xì)菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時(shí)，大約每 20分鐘一代，會(huì)使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個(gè)小時(shí)后，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液 pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素預(yù)防細(xì)菌污染有效。 103 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 微生物污染中以真菌最多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌為卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞?？拐婢苿︻A(yù)防和排除真菌污染有效。 104 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題，是細(xì)胞培養(yǎng)最常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細(xì)胞仍在被應(yīng)用。研究表明， 95％以上是以下四種：口腔支原體（ ）、精氨酸支原體（ ）、豬鼻支原體（ ）和萊氏無膽甾原體（ ），為牛源性。以上是最常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。據(jù)查，目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有 11%的細(xì)胞受到支原體污染。 105 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 污染來源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響 DNA合成，抑制細(xì)胞生長等。 106 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 細(xì)胞培養(yǎng)中，主要從以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染 : ? 控制環(huán)境污染 。 ? 嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作； ? 細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌； ? 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。 107 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有 抗生素處理 、 抗血清處理 、 抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理 。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來講，對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如 內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（ polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是 四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮 ；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。 108 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時(shí)各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化，有些變化較輕、不易察覺，有些可能由于污染的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢最終壓過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制，最終死亡。常用觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分析生長特性和核型、檢測細(xì)胞的標(biāo)記物等方法檢測交叉污染的細(xì)胞。 109 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 污染的排除： 培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其他細(xì)胞。通常選高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種： 110 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對微生物作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好；如果發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以根除。有的抗生素對細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細(xì)胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當(dāng)然，一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用 5－ 10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用 24－ 48小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效。 111 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 2. 加溫除菌 根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于 41℃ 中作用 5－ 10小時(shí)（最長可以達(dá) 18小時(shí)）殺滅支原體。但是 41℃ 對細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。 112 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時(shí)間，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。 113 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)物的污染及防止 在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活 7－ 10天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的克隆生長。與體內(nèi)情況相似，巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用 96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度地同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。本方法與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。 114 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 七 細(xì)胞培養(yǎng)常用營養(yǎng)液和試劑的配制 DHank’s： Nacl 、 Kcl 、 Na2HPO412H2O 、 KH2PO4 、 NaHCO3 800ml雙蒸去離子水中，調(diào)節(jié)溶液 PH值至 ，定容至 1L高壓滅菌， 4℃ 保存（ DHank’s與 Hank’s的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有 Ca2+、 Mg2+，因此 DHank’s常用于配制胰酶溶液） 。 PBS:Nacl 、 Na2HPO412H2O 、 Kcl 、 KH2PO4 于 800ml雙蒸去離子水中，調(diào)節(jié)溶液 PH值至 ，定容至 1L。 115 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 常用營養(yǎng)液和試劑的配制 DMEM：應(yīng)用液中另加 NaHCO3，大濾器過濾除菌后 4℃ 保存，用前繳入 1 105IUL1青霉素 G， 100mgL1鏈霉素； Ⅱ 型膠原酶 ：以 DHank’s液配制成 %使用液，微孔濾膜過濾除菌 胰蛋白酶 ：以 DHank’s液配制成 %使用液，微孔濾膜過濾除菌 。 MTT：以 PH值為 PBS配制成 5gL1，微孔濾膜過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配； ConA和 LPS：用 DMEM培養(yǎng)液配制成 1gL1母液，經(jīng)內(nèi)經(jīng) m的微孔濾膜過濾除菌， 20℃ 保存； 清潔液 ：重鉻酸鉀 120g，濃硫酸 200ml，蒸餾水 1000ml。 116 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) — 細(xì)胞共培養(yǎng) 細(xì)胞共培養(yǎng) (cell coculture) ： 共培養(yǎng)體系即是將兩種細(xì)胞 (可以來自同一組織，也可以來自不同的組織 ) 混合共同培養(yǎng)，從而使其中一種細(xì)胞的形態(tài)與功能穩(wěn)定表達(dá)，并維持較長的時(shí)間。 體外細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)能模擬體內(nèi)生成的微環(huán)境，便于更好地觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機(jī)制和可能作用的靶點(diǎn)，填補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)和整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的鴻溝。 117 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) — 細(xì)胞共培養(yǎng) 細(xì)胞共培養(yǎng)方法： 接觸式共培養(yǎng) 118 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) — 細(xì)胞共培養(yǎng) 非接觸式共培養(yǎng) ? 用一種細(xì)胞的培養(yǎng)上清液 (含有不同生長因子等 ) 與另外一種細(xì)胞共培養(yǎng)； ? 將玻片上 (經(jīng) I型膠原凝膠預(yù)處理 ) 培養(yǎng)的細(xì)胞 B ,以一定的比例放入細(xì)胞 A的培養(yǎng)皿中與其共培養(yǎng)； ? Millicell 插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿 (又名 Transwell小室 )。 119 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) — 細(xì)胞共培養(yǎng) 細(xì)胞共培養(yǎng)應(yīng)用： ? 在干細(xì)胞方面： 干細(xì)胞在體外特定培養(yǎng)條件下可以被誘導(dǎo)分化成具有不同體細(xì)胞表型的細(xì)胞； ? 在腫瘤生物學(xué)方面： 起源于不同器官組織的腫瘤所表達(dá)的細(xì)胞生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)及受體、細(xì)胞酶譜具有明顯差異； ? 在軟骨和骨組織方面： 對促進(jìn)骨組織工程的發(fā)展很重要； ? 在血管方面： 有目的地改變血管形成或是替代病變的血管； ? 在神經(jīng)免疫方面： 神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用。 120 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞庫 國內(nèi)外相關(guān)細(xì)胞庫： ? 中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫： ? 上海細(xì)胞庫： ? 昆明細(xì)胞庫： ? 臺(tái)灣細(xì)胞庫： ? American Type Culture Collection, ATCC： ? Coriell Cell Repositories： ? United Kingdom National Culture Collection, UKNCC： 121 中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所 122 123 124 125 126 127 謝謝聆聽 !