淋巴細(xì)胞分離-資料下載頁
2025-08-05 08:49本頁面
【正文】 分離液，磁珠或流式細(xì)胞術(shù)分離 ? T細(xì)胞亞型分離 T細(xì)胞分離的基礎(chǔ)上，磁珠分離法或流式細(xì)胞術(shù) 淋巴細(xì)胞 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) 淋巴細(xì)胞的保存 （ 1）短期保存：用含有 10～ 20%滅活小牛血清的Hanks、 Tc19 RPMI 1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周。 （ 2）長期保存：在保護(hù)劑二甲基亞砜中于液氮（ 196℃) 中保存。其過秳是：先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含有 10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)， 4℃ 緩沖， 20℃ 結(jié)冰，轉(zhuǎn)秱 80℃ 過夜，繼而進(jìn)行降溫 (196℃) 冷凍。 （ 3）復(fù)蘇：將其從液氮中取出，立即放入 40 ℃ 溫水中，融化后加入 10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) ? 培養(yǎng)條件： （ 1）無菌 （ 2）恒溫：培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在 37177。℃ （ 3）氣體環(huán)境： 02和 C02 。大多數(shù)細(xì)胞的適宜 pH為～ 。 （ 4）培養(yǎng)液： RPMI1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)用無機(jī)鹽、胎牛血清 (FCS)、 HEPES、肝素、淋巴細(xì)胞分離液、植物凝集素 (PHA)和白細(xì)胞介素等。 操作步驟： 洗滌 將收集到的淋巴細(xì)胞集中于離心管中用培養(yǎng)液洗滌兩次，分別以 2500和 2022rpm離心各 10min，棄上清，之后進(jìn)行接種。 細(xì)胞接種 細(xì)胞接種通常是在無菌室超凈工作臺內(nèi)的酒精燈火焰區(qū)進(jìn)行。 搖床培養(yǎng) 將接種后的培養(yǎng)瓶放于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37℃ 、 5%CO飽和濕度。從 72h開始每 48h添加等體積的新鮮培養(yǎng)液。 細(xì)胞活力的測定 —— 臺盼藍(lán)染色法 原理 常用方法是臺盼藍(lán)染色法。這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞著色（藍(lán)色） 步驟： 制備單細(xì)胞懸液。并作適當(dāng)稀釋 (106 細(xì)胞 /ml) 染色：細(xì)胞懸液與 %臺盼藍(lán)溶液以 9:1混合混勻。 計(jì)數(shù)：在三分鐘內(nèi)，用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞結(jié)果統(tǒng)計(jì)： 鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。 根據(jù)下式求細(xì)胞活力： 活細(xì)胞率 (%)= 活細(xì)胞總數(shù) /(活細(xì)胞總數(shù) +死細(xì)胞總數(shù) ) 100 Thank yo
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