【正文】 料〔 FITC〕的山羊抗兔免疫球蛋白抗體。后加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細(xì)胞上，借助熒光即可看到抗原－抗體復(fù)合物。 第一百五十七頁，共一百八十七頁。 同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬 通過確定三種同工酶系統(tǒng)〔 6磷酸葡萄糖脫氫酶〔 G6PD〕，乳酸脫氫酶〔 LDH〕和核苷磷酸化酶〔 NP〕的垂直淀粉膠電泳的遷移率，可以鑒定細(xì)胞系的種屬來源。該法有高度的可靠性，簡單、重復(fù)性好。利用同工酶分析檢驗(yàn)細(xì)胞的交叉污染 G6PD、 LDH、 NP的電泳遷移率差異不僅可用來鑒別細(xì)胞系所屬種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。 第一百五十八頁，共一百八十七頁。 染色體分析 多數(shù)情況下，即使普通顯微鏡觀察技術(shù)，液足以鑒定不同種的染色體結(jié)構(gòu)的差異。 染色體核型分析足以鑒定不同種間細(xì)胞系之間的污染。親緣關(guān)系近的靈長類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞系之間的比較可用 Giemsa顯帶分析。 第一百五十九頁，共一百八十七頁。 人主要組織相容性抗原 人主要組織相容性抗原〔 HLA抗原〕存在大多數(shù)有核細(xì)胞膜上，常用抗原檢測是用補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)，用拒染來鑒定細(xì)胞活性。 原理： HLA抗體與淋巴細(xì)胞外表的相應(yīng)抗原結(jié)合后激活補(bǔ)體，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，通透性增強(qiáng)，染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞死亡。在倒置相差顯微鏡下觀察，著色的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，視野下有較多細(xì)胞死亡為陽性。 第一百六十頁，共一百八十七頁。 核酸技術(shù) 用重組 DNA技術(shù)和 DNA探針技術(shù)鑒定和定量培養(yǎng)細(xì)胞中等位基因的多態(tài)性。 第一百六十一頁，共一百八十七頁。 ? 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程 ? 上皮細(xì)胞培養(yǎng) ? 表皮組織培養(yǎng) ? 肌肉組織培養(yǎng) ? 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 第四節(jié) 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 第一百六十二頁，共一百八十七頁。 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)的歷史 ? 1906年， Beebe和 Ewing最早成功培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細(xì)胞； ? 1911年， Carrel最先在體外培養(yǎng)了纖維軟骨瘤及黑色素瘤細(xì)胞。 ? 1952年， Gey首先成功地建立了世界上第一個細(xì)胞系 —— 來源于子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系，并且是惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。 ? 后來，口腔癌、喉癌、肺癌等細(xì)胞系相繼建立。迄今為止，全球范圍內(nèi)建立的細(xì)胞系目前已經(jīng)超過三位數(shù)。 第一百六十三頁，共一百八十七頁。 開展成就 ? 在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞類型上，經(jīng)歷了從間充質(zhì)源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)上皮源性細(xì)胞、再由神經(jīng)外胚層源性到造血源性的開展歷程。 ? 在培養(yǎng)方法上，經(jīng)歷了從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細(xì)胞系的建立的開展過程。 ? 培養(yǎng)成分上，由采用純血清培養(yǎng)到含血清培養(yǎng)基、再到無血清培養(yǎng)基三個階段。 ? 在對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性研究水平上，經(jīng)歷了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平，再到酶和分子水平的開展時期。 ? 國內(nèi)已建立的腫瘤細(xì)胞系主要有：來自白血病患者的淋巴樣的 J6懸浮生長型的胃癌 SL79上皮型的肝癌 SMMC772鼻咽癌CNE成骨肉癌 OC861結(jié)腸癌 THC8910,以及多形型的胸膜間皮癌 SMC1等等。 第一百六十四頁，共一百八十七頁。 上皮組織的體外培養(yǎng) ? 體外培養(yǎng)細(xì)胞生長的形態(tài)特性 細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)較為一致，細(xì)胞間質(zhì)少 上皮組織的體外培養(yǎng)特性：依賴性、接觸抑制性、細(xì)胞連接、貼壁生長 第一百六十五頁，共一百八十七頁。 表皮組織的體外培養(yǎng) * 表皮細(xì)胞分兩類： 角質(zhì)形成細(xì)胞、非角質(zhì)形成細(xì)胞 * 角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)： 1975年，萊因沃德〔 Rheinwald〕和格林〔 Green〕創(chuàng)立飼養(yǎng)層培養(yǎng)法 第一百六十六頁，共一百八十七頁。 ? 上皮細(xì)胞培養(yǎng)液：近年來，國外一些公司研制了多種成品上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，例如適用于角化上皮細(xì)胞的 KGM，適用于一般表皮細(xì)胞的 EGM等，使用很方便。 ? 結(jié)果及鑒定 ? 培養(yǎng)的細(xì)胞必須鑒定，以排除間充質(zhì)細(xì)胞混雜。表皮細(xì)胞對角蛋白特異性單克隆抗體反響陽性，間充質(zhì)細(xì)胞對波型絲特異性單克隆抗體反響陽性。培養(yǎng)初期可觀察到上皮細(xì)胞的纖維樣細(xì)胞混雜生長經(jīng)數(shù)次傳代后纖維樣細(xì)胞逐漸消失。 ? 【 3T3細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)和照射處理】 ? 3T3細(xì)胞是 Swiss鼠成纖維細(xì)胞，在表皮細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常用照射處理過的 3T3細(xì)胞作滋養(yǎng)層， 3T3細(xì)胞一般應(yīng)維持在低密度條件下培養(yǎng)。在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種 5 106~105個即可，培養(yǎng) 3~4d可獲得 3~5 106個細(xì)胞，可再行胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。如果用于照射處理，將胰蛋白酶消化的細(xì)胞懸浮于含 10%胎牛血清的 MEM培養(yǎng)液中，在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種 106個細(xì)胞，在鈷源下給予 60Gy〔 6,000rads〕照射劑量，培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)液，待用。 第一百六十七頁，共一百八十七頁。 肌肉組織的體外培養(yǎng) 〔 1〕肌肉組織的特點(diǎn) 肌肉組織〔肌組織〕細(xì)胞間結(jié)締組織少、血管和神經(jīng)豐富。肌細(xì)胞長梭形，又稱肌纖維。 肌肉組織培養(yǎng)：指將肌肉組織植塊或分散的肌肉細(xì)胞在離體條件下生存、生長或發(fā)育的技術(shù)。 〔 2〕骨骼肌的培養(yǎng) 第一百六十八頁，共一百八十七頁。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 神經(jīng)組織包括：神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 1907年，哈里森首創(chuàng)培養(yǎng)方法。經(jīng)歷了組織塊培養(yǎng) →別離細(xì)胞培養(yǎng) →單一型細(xì)胞階段 第一百六十九頁，共一百八十七頁。 神經(jīng)原細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)原細(xì)胞培養(yǎng)需要極高的營養(yǎng)條件，培養(yǎng)器皿也需要經(jīng)過特殊處理，神經(jīng)軸突在膠原和聚 L—賴氨酸〔 PolyLlysine〕溶液中可以旺盛生長，神經(jīng)生長因子〔 NGF〕可促進(jìn)神經(jīng)原的生長。 從出生 4~8d的大鼠腦組織取材培養(yǎng)，培養(yǎng)液中參加胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神經(jīng)原細(xì)胞，可獲得特征明顯的腦神經(jīng)細(xì)胞。根本方法是取新生大鼠腦，切成小塊，用 HBSS胰酶消化，37℃ 15min，將細(xì)胞懸液接種于聚 L— 賴氨酸覆蓋內(nèi)底面的培養(yǎng)器皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 【用品】 DMEM培養(yǎng)液：其中加有 10%熱滅胎牛血清， 30m mol/L葡萄糖， — 谷氨酰胺， mol/L KCL， 100mU/L胰島素， 7μmol/L P— 氨基苯酸， 100μg/ml慶大霉素 Hands 平衡鹽液，其中參加牛血清白蛋白 3g/L (HBSS) 聚 L— 賴氨酸，分子量大于 300,00 胞嘧啶阿拉伯糖 Ⅱ 型胰蛋白酶〔 %，溶于 HBSS〕 硅膠〔 Aquasil, Pierce 42799〕 ， Pasteur滴管， 10ml移液器〔無菌〕 12ml和 50ml無菌試管、無菌手術(shù)器械、水浴箱 【鑒定方法】 用神經(jīng)原特異性烯醇抗體或破傷風(fēng)毒素作為標(biāo)記物，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測可判定神經(jīng)原細(xì)胞；用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白作為標(biāo)記物可判斷混雜在其中的膠質(zhì)細(xì)胞。 第一百七十頁，共一百八十七頁。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途 ? 1. 藥物研究與開發(fā) ? (1) 新藥篩選 :如化學(xué)合成藥物藥效研究 ,中藥有效成分篩選與鑒定等 . ? (2) 疫苗研究與開發(fā) :如病毒性疫苗的研究與開發(fā) (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗(多肽疫苗 )等 . ? (3) 基因工程藥物研究與開發(fā) :如干擾素研究與開發(fā) ,細(xì)胞生長因子研究與開發(fā)等 . ? (4) 細(xì)胞工程藥物研究與開發(fā) :生物活性多肽研究與開發(fā) ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā) . ? (5) 單克隆抗體制備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 . ? 根底研究 ? (1) 藥物作用機(jī)理 ? (2) 基因功能 ? (3) 疾病發(fā)生機(jī)理 ? 2, 生物制藥 ? (1) 疫苗生產(chǎn) :如病毒性疫苗 (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 . ? (2) 基因工程藥物生產(chǎn) :如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價值的一些細(xì)胞生長因子如干擾素 ,粒細(xì)胞生長因子 ,胸腺肽等 (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn) ? (4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn) :生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽 ,生物活性物質(zhì)等 第一百七十一頁，共一百八十七頁。 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 * 目前存在的主要問題 : 〔 1〕細(xì)胞密度低 ,產(chǎn)物濃度低。 〔 2〕細(xì)胞群體在大規(guī)模 ,長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力易喪失 ,或產(chǎn)物活性易降低。 〔 3〕動物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體昂貴。 〔 4〕目前對細(xì)胞代謝和生長動力學(xué)的研究比較欠缺。 〔 5〕在線監(jiān)控水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 第一百七十二頁，共一百八十七頁。 第五節(jié) 細(xì)胞同步化 細(xì)胞同步化培養(yǎng) 指自然或人工方法獲得細(xì)胞群體的細(xì)胞周期同步化生長。 第一百七十三頁，共一百八十七頁。 細(xì)胞同步化培養(yǎng) 指自然或人工方法獲得細(xì)胞群體的細(xì)胞周期同步化生長。 篩選同步化細(xì)胞 誘導(dǎo)同步化細(xì)胞 M期細(xì)胞震蕩脫落法 離心洗脫法 梯度沉降法 血清饑餓法 異亮氨酸營養(yǎng)缺乏法 DNA合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法 第一百七十四頁，共一百八十七頁。 第六節(jié) 器官培養(yǎng) ? 定義與特點(diǎn) ? 器官培養(yǎng)技術(shù) 第一百七十五頁，共一百八十七頁。 1 定義與特點(diǎn) 器官培養(yǎng)：取出動物器官或進(jìn)一步修整成器官型植塊，將其培養(yǎng)使其存活和生長的過程。 1897年，利奧勃〔 Leob〕首創(chuàng)。 第一百七十六頁，共一百八十七頁。 人體器官培養(yǎng)的共同點(diǎn)： 〔 1〕培養(yǎng)對象為胚胎組織的某一器官或非胚胎組織器官的一局部 〔 2〕被培養(yǎng)對象浸泡在培養(yǎng)液中 〔 3〕培養(yǎng)器官從培養(yǎng)液中獲氧及養(yǎng)料，同時排廢物 第一百七十七頁，共一百八十七頁。 器官培養(yǎng)特征 〔 1〕被培養(yǎng)的器官在體外存活較長時間，并保存相對正常的功能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常的代謝甚至增殖。而器官保存無細(xì)胞增殖 〔 2〕被培養(yǎng)物為一完整器官或具有完整功能的某一器官的一局部，如肝 〔 3〕器官培養(yǎng)不能從一個變成多個，而細(xì)胞培養(yǎng)過程中有細(xì)胞量的增加 第一百七十八頁，共一百八十七頁。 2 器官培養(yǎng)技術(shù) 器官培養(yǎng)可分為：胚胎器官培養(yǎng)和成年器官培養(yǎng) 培養(yǎng)原那么：① 提供充足的氧氣和養(yǎng)料，及時排除廢物。② 抑制細(xì)胞從植塊向外遷移 第一百七十九頁，共一百八十七頁。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 〔 1〕表玻璃器官培養(yǎng)法 1929年，費(fèi)爾〔 Fell〕和魯濱遜 〔 Robinson〕建立 〔 2〕瓊脂凝膠培養(yǎng)法 沃爾夫〔 Wolff〕和施奈德〔 Schneider〕 第一百八十頁，共一百八十七頁。 第一百八十一頁，共一百八十七頁。 〔 3〕懸浮培養(yǎng)法 〔 4〕直接漂浮培養(yǎng)法 1948年，梅達(dá)沃〔 Medawar〕設(shè)計 〔 5〕擦鏡紙培養(yǎng)法 第一百八十二頁，共一百八十七頁。 〔 6〕金屬格柵器官培養(yǎng)法 1954年，特羅爾〔 Trowell〕創(chuàng)立。 〔 7〕瓊脂小島器官培養(yǎng)法 〔 8〕陳氏濾紙虹吸器官培養(yǎng)法 1964年，陳瑞銘創(chuàng)造。 〔 9〕旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 1933年，蓋爾〔 Gey〕建立。 〔 10〕搖擺式器官培養(yǎng)法 1976年，巴雷特〔 Barret〕創(chuàng)立 第一百八十三頁，共一百八十七頁。 現(xiàn)代器官培養(yǎng) —— 灌流式器官培養(yǎng)法 1938年，卡雷爾〔 Carrel〕和林德伯格〔 Lindberg〕嘗試 器官培養(yǎng)應(yīng)用舉例 〔 1〕軟骨的培養(yǎng) 〔 2〕神經(jīng)組織的器官培養(yǎng) 〔 3〕血管的培養(yǎng) 〔 4〕肝臟的培養(yǎng) 第一百八十四頁，共一百八十七頁。 第一百八十五頁，共一百八十七頁。 最新進(jìn)展 * 生物反響器培養(yǎng)拇指指骨 * 在豬身上培育人體動脈 * 生物工程人造腎臟、乳腺、膀胱、 * 人造角膜 * 1996年，我國曹誼林教授培養(yǎng)出 “人耳〞。 第一百八十六頁，共一百八十七頁。 內(nèi)容總結(jié) 第三章 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)。間期〔 G1+S+G2〕。 傳代。 3 分裝：每瓶 1ml，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。過程監(jiān)控：在線氧吸收速率、葡萄糖分析，親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)等。用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白作為標(biāo)記物可判斷混雜在其中的膠質(zhì)細(xì)胞。 (1) 新藥篩選 :如化學(xué)合成藥物藥效研究 ,中藥有效成分篩選與鑒定等 .。 * 人造角膜 第一百八十七頁，共一百八十七頁。