細(xì)胞破碎技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-08-15 20:38本頁(yè)面
【正文】 ,收集上清液→ 純化。 ?不溶性包涵體：離心 ,收集菌體 → 細(xì)胞破碎 → 離心 ,收集沉淀 → 包涵體洗滌 → 目標(biāo)蛋白變性溶解→ 復(fù)性 → 純化。 56 外源蛋白在大腸桿菌中的積累 蛋白 產(chǎn)物占菌體總蛋白 外源蛋白的積累 人胰島素 50% 形成包涵體 β 丙酰胺酶 20% 在細(xì)胞間區(qū) γ 人體干擾素 25% 形成包涵體 凝乳酶原 形成包涵體 牛生長(zhǎng)激素 30% 形成包涵體 β 內(nèi)酰胺酶 形成間區(qū)包涵體 人胰島素原 5%~26% 形成包涵體 57 ?包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。 ?包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。 ?高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？ ① 蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀； ②蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀； ③蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀； ④表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合 /誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài) ⑤蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。 包含體的構(gòu)成 58 基因工程包涵體的純化方法 收集菌體細(xì)胞 細(xì)胞破碎 包涵體 的洗滌 目標(biāo)蛋白的變性溶解 目標(biāo)蛋白的復(fù)性 包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。 欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。 59 包涵體獲得 幾種常見(jiàn)的工藝路線(xiàn) (一 ) 機(jī)械破碎 (高壓勻漿、高速珠磨） 離心提取包含體 加變性劑溶解 除變性劑復(fù)性 60 特點(diǎn) :是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開(kāi)，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。 優(yōu)點(diǎn)： 擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。 缺點(diǎn) :要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。 路線(xiàn) 1 的特點(diǎn) 61 包涵體獲得 幾種常見(jiàn)的工藝路線(xiàn)（二） 機(jī)械破碎 膜分離獲得包涵體 加變性劑溶解包含體 除變性劑復(fù)性 62 路線(xiàn)（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)。 ?優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。 ?缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。 路線(xiàn) 2 的特點(diǎn) 63 包涵體獲得 幾種常見(jiàn)的工藝路線(xiàn)（三） 化學(xué)破碎 （加變性劑） 離心除細(xì)胞碎片 除變性劑復(fù)性 64 ? 用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。 ? 缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒(méi)有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來(lái)困難。 路線(xiàn)三： 65 1）包涵體的洗滌 ?細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。 ?洗滌的重要性： 收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難。 ?洗滌劑： 溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)。 ?洗滌劑濃度 以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。 66 2）目標(biāo)蛋白的變性溶解 包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑： ▲ 58 mol/L鹽酸胍和 68 mol/L尿素 , 作用：破壞離子間相互作用； ▲ 表面活性劑如 12％ 十二烷基硫酸鈉 SDS， 作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。 ▲ PH，使用較少。 影響變性因素：時(shí)間、 pH、離子強(qiáng)度、變性劑種類(lèi)和濃度。 67 原理： 在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵沒(méi)有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會(huì)重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過(guò)程稱(chēng)復(fù)性。 復(fù)性方法： ?稀釋法除變性劑 － 加入大量水或緩沖液。 ?膜分離法除變性劑 － 透析、超濾、電滲析。 ?層析法：凝膠層析， 高效疏水層析 3） 目標(biāo)蛋白的復(fù)性 68 蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素： ?變性劑濃度 ?目標(biāo)蛋白濃度； ?pH和離子強(qiáng)度； ?氧化還原條件。 還原劑： 二硫蘇糖醇、 β巰基乙醇、還原型谷胱甘肽； 氧化劑： 氧化型谷胱甘肽 。 堿性下通空氣。 復(fù)性區(qū) 多聚物生成區(qū) 絮凝沉淀區(qū) 鹽酸胍濃度 mol/L 紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑 與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性的影響 蛋白質(zhì)濃度 mol/L 69 包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長(zhǎng)激素分離提?。? 超 濾 器濾 液透 析 器緩 沖 液凝 膠 過(guò) 濾 柱超 濾 器濾 液水E D T A細(xì) 胞 壁 溶 解 酶 緩 沖 液攪 拌 混 合 罐水 高 壓 勻 漿 器鹽 酸 胍上 相攪 拌 混 合 罐緩 沖 液離 心 機(jī)下 相發(fā) 酵 罐粗 包 含 體攪 拌 混 合 罐空 氣70 思考題 1. 常用的細(xì)胞破碎方法有哪些 2. 在選擇細(xì)胞破碎方法時(shí)需要考慮哪些因素？ 3. 基因工程包含體的純化方法。
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