聚合酶鏈反應(yīng)-資料下載頁
2025-08-05 16:17本頁面
【正文】 長約15－20bp，故LCR擴(kuò)增產(chǎn)物長約30－40bp。由于擴(kuò)增產(chǎn)物較短，循環(huán)反應(yīng)中的變性溫度一般應(yīng)比常規(guī)PCR要低。熱穩(wěn)定連接酶分離自嗜熱細(xì)菌，它能精確識別與模板正確雜交的寡核苷酸引物。由于堿基誤配而雜交上模板的非特異引物將不能起連接反應(yīng)。與PCR相比較，LCR中非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的幾率很低，有資料表明，經(jīng)過50－70個LCR循環(huán)，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物未有明顯增長，這樣，可保證反應(yīng)的高度敏感性和特異性。LCR已應(yīng)用于檢測人乳頭瘤病毒、結(jié)核分枝桿菌等病原體。目前，LCR的應(yīng)用范圍遠(yuǎn)不如 PCR廣泛，但LCR與PCR相結(jié)合，可有效解決分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一些問題，如啟動子等小片段核酸的克隆等。(三) Qβ復(fù)制酶技術(shù) Qβ復(fù)制酶是Qβ噬菌體產(chǎn)生的一種依賴于RNA的RNA聚合酶。該酶于1963年由 Haruna和Weissmann等人發(fā)現(xiàn)并命名。Qβ復(fù)制酶能以某些單鏈RNA為模板，在體外大量復(fù)制單鏈RNA。該酶有嚴(yán)格的模板特異性，能在體外充當(dāng)Qβ復(fù)制酶模板的所有RNA分子均含大量的二級結(jié)構(gòu)，且模板和產(chǎn)物RNA必須能在復(fù)制過程中形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)。Lizardi及其合作者(1988)發(fā)現(xiàn)，在Qβ復(fù)制酶的天然模板MDV1 RNA中插入一段瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的特異序列后，所形成的重組RNA片段仍可做為模板被Qβ復(fù)制酶大量擴(kuò)增。經(jīng)37℃反應(yīng)半小時，可在模板含量最低的反應(yīng)體系(約含1 000個分子)檢測到 129ng的重組RNA分子，相當(dāng)于1億倍擴(kuò)增。Qβ復(fù)制酶能擴(kuò)增經(jīng)過修飾的RNA片段，因此可應(yīng)用于診斷和檢測單鏈RNA或DNA序列。據(jù)1992年發(fā)表的有關(guān)資料介紹，Gene Trak Systems的科研工作者已在用Qβ復(fù)制酶開發(fā)傳染病診斷的技術(shù)。其技術(shù)要點(diǎn)如下：先用硫氰酸胍處理生物材料(如血、尿、腦脊髓液)，使 RNA釋放出來。由于Qβ復(fù)制酶通常不復(fù)制欲擴(kuò)增的特異RNA序列，如HIV－1 RNA；因此，待檢材料須再做如下處理，先用一捕獲探針(捕獲探針與一種磁性小球偶聯(lián))通過雜交反應(yīng)將HIV1 RNA“釣”出來，隨后洗脫其它未結(jié)合的RNA分子；將捕獲探針和HIV1 RNA的復(fù)合體與插入另一段HIV1 RNA序列的重組MDV1 RNA進(jìn)行溫育，重復(fù)洗滌除去未與復(fù)合體結(jié)合的重組MDV1 RNA，最后加入Qβ復(fù)制酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。Qβ復(fù)制酶將只擴(kuò)增與捕獲探針和HIV1 RNA所形成的復(fù)合體相結(jié)合的重組MDV1 RNA，30分鐘可擴(kuò)增106 107倍。這一技術(shù)不直接擴(kuò)增欲檢測的特異序列，而通過擴(kuò)增與欲檢測RNA分子相結(jié)合的 MDV1 RNA來顯示前者的存在。因此，它與PCR不同，需先“釣出”欲擴(kuò)增的特異序列，這樣雖增加了處理步驟，但可大大減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。Qβ復(fù)制酶技術(shù)尚待完善，但做為一項(xiàng)核酸擴(kuò)增技術(shù)，亦具備可觀的應(yīng)用潛力。
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