廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬藍(lán)耳病病毒美洲型經(jīng)典株、變異株以及歐洲型毒株的檢測多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿編制說明-資料下載頁
2025-08-20 18:55本頁面
【正文】 、PRV、PPV、BVDV 均為陰性，沒有交叉反應(yīng)（圖 2）。圖1 PRRSV多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)圖M. 100 bp 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 1. 重組質(zhì)?；旌衔?；2. pEUORF567；3 .美洲型經(jīng)典株cDNA.；4. 美洲型變異株cDNA；圖2 多重PCR的特異性試驗(yàn)M. 100 bp 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 1. 混合重組質(zhì)粒。 2. FMDV。 3. CSFV。 4. PCV2。 5. PRV。 6. PPV、7. BVDV。 8. 陰性對照（3）多重PCR 法的敏感性試驗(yàn)敏感性試驗(yàn)分別以10 倍系列稀釋的 4 種質(zhì)粒為模板進(jìn)行單重 PCR。結(jié)果顯示，COORF7引物對以pAMORF7 和 102拷貝/μL；AMNsp2引物對以pNsp2VR2332 和pNsp2JXA1 質(zhì)粒為模板的檢出下限均為 102拷貝/μL；EUORF5引物對以 pMDEUORF7 103拷貝/μL。而將10 倍系列稀釋的 4種重組質(zhì)粒等體積混合后作為模板進(jìn)行多重PCR，結(jié)果顯示，3 對引物的檢出下限均為 103 拷貝/μL（圖3）。 M: 100 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 19: 109~101 拷貝/μL。 10: 陰性對照圖3 多重PCR 的敏感性試驗(yàn)（4）多重PCR法的重復(fù)性試驗(yàn)以pAMORFpEUORFpNsp2VR233pNsp2JXA1 等 4 106 拷貝/μL的混合物作為模板，在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行多重 PCR。結(jié)果顯示，5 次重復(fù)試驗(yàn)均能夠擴(kuò)增出均勻一致的目的片段，具有很好的重復(fù)性。（5）多重 PCR 法對臨床樣品的檢測 應(yīng)用所建立的多重 RTPCR 方法對 203 份臨床病料進(jìn)行檢測， 結(jié)果PRRSV 陽性 45 份，陽性率為 %。其中，美洲型經(jīng)典株 4 份，HPPRRSV 株 41 份；未檢測到歐洲型病毒株，也未檢測到美洲型經(jīng)典病毒株和HPPRRSV 株混合感染的情況。隨機(jī)選取經(jīng)典 PRRSV 陽性樣品 4 份、HPPRRSV 株陽性樣品 5 份，回收 PCR 產(chǎn)物，測序結(jié)果表明均為 PRRSV。部分臨床病料檢測結(jié)果見圖 4。應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 180902008 中規(guī)定的 RTPCR 方法對上述 203 份臨床病料進(jìn)行檢測，結(jié)果 PRRSV 陽性 45 份，與本研究所建立的多重 RTPCR 方法檢測結(jié)果的符合率為100 %。M：100 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：陽性對照；212：臨床樣品；13：陰性對照圖4 部分臨床陽性樣品的檢測結(jié)果五、與現(xiàn)行法律、法規(guī)和有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系目前，國內(nèi)尚無應(yīng)用多重 RTPCR方法檢測PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株以及歐洲型毒株的國家、農(nóng)業(yè)行業(yè)或地方標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)制訂的條款未與現(xiàn)行的法律、法規(guī)以及有關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中任何條款相矛盾。六、采用國際標(biāo)準(zhǔn)或國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的情況以國內(nèi)同類標(biāo)準(zhǔn)的編寫方法為基礎(chǔ)，對本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范、充實(shí)和創(chuàng)新，使之具有先進(jìn)性。七、主要反饋意見的處理情況暫無。八、地方標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性地方標(biāo)準(zhǔn)或推薦性地方標(biāo)準(zhǔn)的建議本項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的制訂，已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和臨床實(shí)踐的驗(yàn)證，可作為推薦性地方標(biāo)準(zhǔn)，用于PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株以及歐洲型毒株的鑒別檢測。九、貫徹地方標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議 加大對基層單位的宣貫和培訓(xùn)力度。加大投入，爭取推出商品化和標(biāo)準(zhǔn)化的診斷試劑盒，便于基層單位使用。爭取升格為國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，滿足全國需要。十、其他應(yīng)予說明的事項(xiàng)無。13
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