【正文】 因組。RDA可以把單拷貝的外源基因組從高度復(fù)雜的人染色體 DNA本底中檢測(cè)出來。 RDA流程 分別提取實(shí)驗(yàn)組 (Tester)和對(duì)照組(Driver或驅(qū)動(dòng)子 )的總 RNA或者 DNA 用四堿基內(nèi)切酶充分酶切，分別連上寡核苷酸接頭，并用特異性的接頭引物擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物去除接頭，再在實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增子上連上新接頭，將兩份擴(kuò)增子雜交，以新接頭為引物進(jìn)行擴(kuò)增 只有那些未能與驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增子雜交而自身退火的樣品 DNA的兩端因都能與引物配對(duì)才以指數(shù)形式擴(kuò)增，而待檢樣品單鏈 DNA和驅(qū)動(dòng)樣品 DNA只有一端與引物配對(duì)而線性擴(kuò)增 GBV病毒的發(fā)現(xiàn) ? GB肝炎是 Deinhardt等在 1970年首先報(bào)道。后研究表明 GB肝炎因子不同于甲 戊型肝炎病毒。 ? 1995年 Simons等用 GB肝炎因子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血漿，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA作 RDA分析， 7個(gè) cDNA克隆序列分析表明，屬于兩種黃病毒，與 HCV有一定同源性命名為 GBVA和 GBVB。 RDA的缺點(diǎn) ?其本身不能消除不同 mRNA分子豐度的差異 ,因而往往需要進(jìn)行多輪雜交 ?而每輪雜交都涉及到接頭的連接和去除效率問題以及綠豆核酸酶消化去除單鏈等操作 抑制性消減雜交技術(shù)（ SSH） ? 1996年 Diatchenko等將抑制性 PCR和減法雜交結(jié)合起來，創(chuàng)立了 SSH技術(shù)。 ? 該技術(shù)通過接頭特異性的引物選擇性地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)基因片段的同時(shí)，可以抑制非靶片段的擴(kuò)增。 ? 利用雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理巧妙地在減法雜交過程中消除了不同 mRNA分子間豐度的差異，因而通過一次減法雜交可將差異片段富集 1000倍以上。一般只需兩輪雜交， 34天即可得到幾十或上百個(gè)差異片段 SSH的基本步驟 RDA與 SSH ? 原理相似：都是建立在 PCR技術(shù)和減法雜交的基礎(chǔ)上。 RDA是先對(duì)樣品的 cDNA進(jìn)行擴(kuò)增再雜交，而 SSH則是先減法雜交再擴(kuò)增。兩者都具有高效、重復(fù)性好、陽性率高等優(yōu)點(diǎn)。 ? 共同的缺點(diǎn)：由于驅(qū)趕子和待檢測(cè)的標(biāo)本的背景往往不完全相同，富集的差異片段可能不是微生物學(xué)鑒別的有用標(biāo)記。 最新的技術(shù) 序列非依賴的擴(kuò)增法： ? 隨機(jī) PCR(random PCR)技術(shù) ? 序列非依賴的單引物擴(kuò)增 (SISPA: sequence independent single primer amplification） Random PCR ? 基本原理：在合成隨機(jī)引物時(shí)在其加上一個(gè)相同的接頭，這個(gè)接頭含有一個(gè)限制性的酶切位點(diǎn)可以便于隨后的片斷克隆進(jìn)載體，然后對(duì)插入序列測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)即可初步獲得未知病毒的種系來源信息。這種隨機(jī) PCR法不僅可以檢出 DNA病毒也可以檢出RNA病毒。 ? 利用這種方法 Allander等在 2022年在呼吸道感染的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了一種人的 parvovirus； ? Stang A等也在 2022年使用這種方法在慢性疲勞綜合癥的病人漱口液中意外檢測(cè)出了 HSV1型病毒。 SISPA ? SISPA是單引物擴(kuò)增法中最常用的一種方法，用于鑒定低濃度的未知序列的病毒核酸。 ? 基本原理：對(duì)基因組 DNA常用識(shí)別四個(gè)堿基的酶先切割，然后在雙鏈核酸片段的兩端連接上一個(gè)相同序列的接頭（ adaptor），這個(gè)接頭可作為隨后 PCR反應(yīng)的引物，進(jìn)行單引物擴(kuò)增。通過將這些產(chǎn)物克隆即可進(jìn)行測(cè)序。 ? SISPA有很多的衍生方法，主要是通過對(duì)引物進(jìn)行修飾如引入酶切位點(diǎn)、單鏈接頭或者平頭、粘性末端；或者是未知的病原的核酸通過不同的酶進(jìn)行切割，所得片斷的兩端引入不同的接頭以提高擴(kuò)增的特異性。 ? SISPA的檢測(cè)低限是 106個(gè)拷貝 /ml，而它的靈敏度取決于臨床標(biāo)本的種類以及未知病毒的屬性。 RDA和 SISPA ? 隨機(jī) PCR方法和 SISPA是未知病毒檢測(cè)中操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單的方法，通過序列非依賴的擴(kuò)增即可擴(kuò)增出大量的病毒基因片段， ? 但實(shí)際操作過程中會(huì)有很多的假陽性，主要是因?yàn)榻宇^或隨機(jī)引物的可以非特異性結(jié)合試劑中存在的一些核酸（污染源）。 ? SISPA相對(duì)于隨機(jī) PCR存在接頭連接效率的問題。 ? SISPA和隨機(jī) PCR方法的缺點(diǎn)是都很耗精力，因?yàn)楸仨毞治龊芏鄠€(gè)克隆，才可能找到所需要的病原體基因。 方法 關(guān)鍵環(huán)節(jié) 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) cDNA文庫(kù)篩選 構(gòu)建文庫(kù) 適用范圍廣 過程繁瑣，工作量大，需篩選大量的克隆 基于保守序列的 PCR 引物的選擇 簡(jiǎn)便高效 局限于檢測(cè)同源性相近的未知病毒 代表性差異分析 基于 PCR技術(shù)的消減雜交 非常靈敏 不能消除不同 mRNA豐度的差異，需多輪雜交，涉及接頭連接和去除的效率，技術(shù)難 抑制性消減雜交 差異雜交的cDNA消減 重復(fù)性高 靈敏度低，不易檢測(cè)低豐度基因 SISPA 接頭與片斷的連接、克隆篩選 適用范圍廣 易受試劑中的核酸污染，工作量大，需篩選大量的克隆 隨機(jī) PCR法 克隆篩選、減少污染 適用范圍廣、簡(jiǎn)便 易受試劑中的核酸污染，工作量大，需篩選大量的克隆 芯片 芯片的設(shè)計(jì) 通量大 成本高，無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾 滾環(huán)擴(kuò)增法 滾環(huán)復(fù)制 高效 只適合于環(huán)狀病毒 實(shí) 戰(zhàn) 舉 例 傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法與最新技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用 A Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome virusisolation techniques electronmicroscopical histologic studies Molecular and serologic assays Primer pair IN2 (+) 539。GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA339。 IN4 (–) 539。TAACACACAACICCATCATCA339。 conserved regions of open reading frame 1b A 405nucleotide segment The Genome sequence of the SARSassociated coronavirus Science 300 (5624), 13991404 (2022) ?Virus isolation ( bronchoalveolar lavage specimen) ?Viral particles were purified, ?geic material (RNA) was extracted ?RNA was converted to cDNA by randompriming and oligo(dT) primings trategy ? Sizeselected cDNA products were cloned ? single sequence reads ?Sequences were assembled ?Rapid amplification of cDNA ends [RACE] to capture the 5 end of the viral genome. 病毒性感染樣本（咽拭子，痰，肺泡灌洗液，腦脊液） 保存活病毒樣本 核酸抽提、逆轉(zhuǎn)錄 多重 PCR擴(kuò)增和質(zhì)譜分析 陽性 陰性 部分樣品進(jìn)行病毒培養(yǎng) 陰性 陽性 部分樣品進(jìn)行基因芯片檢測(cè) 陰性 陽性 病毒擴(kuò)增，電子顯微鏡觀察，病毒核酸的分子克隆，序列的比對(duì)，進(jìn)化分析以及基因功能的初步探討。 DNaseI處理 Random PCR 克隆擴(kuò)增 DNA，大規(guī)模測(cè)序，核酸序列比對(duì)，進(jìn)化樹分析。 不明原因感染的病原體篩查系統(tǒng) 謝 謝！