【正文】 類）標(biāo)記抗體后，將標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合，然后用電子顯微鏡觀察的技術(shù)。又稱電子顯微鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 2. 種類： (1) 非包埋法免疫染色： 該法是以超薄冷凍切片免疫染色。因該法不經(jīng)脫水和包埋等步驟，抗原保護(hù)較好，且有利于免疫試劑在組織中的滲透；但在技術(shù)上困難較多，需配制專用設(shè)備。 (2) 包埋前免疫染色： 組織固定 ? 厚切片 ?免疫染色 ?包埋 ?超薄切片? 投射電鏡觀察。 (3) 包埋后免疫染色： 組織固定 ? 包埋 ?超薄切片 ?免疫染色 ? EM觀察。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 第五節(jié) 免疫學(xué)原理在魚蝦病害防治中的應(yīng)用 一、用于疾病的診斷 （免疫診斷方法有二類） ： 用已知抗原與從患病動(dòng)物中提取的抗體進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，以確定病原種類。該法只能用于病體已產(chǎn)生抗體的診斷。 ： 將已知抗體與從病體中分離的病原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，以確定病原的種類，該法適于所有被診斷動(dòng)物。 診斷方法 特點(diǎn) 抗體檢測(cè)量 應(yīng)用范圍 血清中和試驗(yàn) 靈敏度高，費(fèi)時(shí) ≥103?g/ml 病毒病 沉淀反應(yīng) 方便可靠，靈敏度低 ≥20 細(xì)菌病 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 靈敏度高，存在干擾 ≥101 細(xì)菌病 凝集反應(yīng) 快速準(zhǔn)確，應(yīng)用局限 ≥3?102 部分細(xì)菌病 免疫熒光 快速方便，需特殊儀器 ≥20 細(xì)菌病 放射免疫測(cè)定 快速靈敏，需特殊儀器 ≥103 病毒病 ELISA 快速靈敏，應(yīng)用前景好 ≥103 細(xì)菌病 二、用于疾病的治療 利用被動(dòng)免疫，即給患病動(dòng)物接種抗體進(jìn)行應(yīng)急治療。 過程： 先將抗原（疫苗）注入同種或其他種動(dòng)物機(jī)體， 14周后從接種動(dòng)物的血液等部位提取抗體（或制備卵黃抗體），并將提取的抗體接種到患病動(dòng)物中進(jìn)行疾病治療。 三、用于疾病的預(yù)防 ? 水產(chǎn)動(dòng)物免疫最重要的應(yīng)用方向?yàn)檠兄埔呙邕M(jìn)行疾病的預(yù)防 ? 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中，由于只有魚類、兩棲類和爬行類等脊椎動(dòng)物 才能在接種抗原后產(chǎn)生抗體，目前因此也認(rèn)為只有這些動(dòng)物才能用免疫學(xué)方法進(jìn)行疾病的預(yù)防。 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 （一）魚用疫苗的種類 A. 根據(jù)疫苗的獲得方法來分： 1. 死疫苗 (滅活疫苗 )： 熱滅活、化學(xué)滅活、紫外線滅活、超聲滅活等 優(yōu)點(diǎn)： 安全性好，制造簡單； 缺點(diǎn)： 免疫劑量大，免疫持久性差。 2. 活疫苗： 包括弱毒疫苗和異種疫苗 優(yōu)點(diǎn)： 弱毒疫苗 — 免疫原性好，免疫劑量少，持續(xù)時(shí)間長 異種疫苗 — 安全性好，免疫時(shí)間長。 缺點(diǎn)： 弱毒疫苗 — 安全性差 異種疫苗 — 獲得比較困難 3. 化學(xué)疫苗： 以化學(xué)方法提取病菌有效成分 (如 LPS)制成 優(yōu)點(diǎn)： 免疫劑量小，免疫原性強(qiáng)，作用穩(wěn)定； 缺點(diǎn)： 制造較復(fù)雜，成本稍高。 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 4. 亞單位疫苗： 病原微生物中能使機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)力的成分只占病原體小部分，將這些成分分離出來制成的疫苗為亞單位疫苗。 優(yōu)點(diǎn)： 可除去有害成分，減少異常反應(yīng)，提高免疫效果； 缺點(diǎn)： 制造過程復(fù)雜、成本高。 5. 基因工程疫苗： 將病原的主要免疫原性蛋白的密碼基因 DNA 轉(zhuǎn)移、重組后獲得 優(yōu)點(diǎn)： 易于規(guī)模生產(chǎn)，成本低； 缺點(diǎn)： 研究周期長，免疫原成分單一，產(chǎn)生抗體量小。 6. 合成疫苗： 將具有保護(hù)性免疫力的人工合成肽與適當(dāng)載體結(jié)合后，再加入佐劑制成的疫苗稱為合成疫苗 優(yōu)點(diǎn)： 作用效果好，易于規(guī)模生產(chǎn)； 缺點(diǎn)： 研究難度大。 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 B. 根據(jù)疫苗的性質(zhì)和組成成分來分： 1. 單價(jià)疫苗： 由單一病菌培養(yǎng)制備的疫苗 2. 多價(jià)疫苗： 由同一種病菌的不同型或不同株培養(yǎng)制備的疫苗 3. 聯(lián)苗 (混合疫苗 )： 由一種以上的病菌或其代謝產(chǎn)物制備的疫苗 如：二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗 …… C. 根據(jù)抗原類別來分： 1. 病毒疫苗： 如草魚出血病疫苗 2. 細(xì)菌疫苗： 如石斑魚創(chuàng)傷弧菌疫苗 3. 寄生蟲疫苗： 如小瓜蟲疫苗 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 （二）魚用疫苗的接種方法 1. 注射法： 將疫苗直接注射到肌肉、腹腔或心臟的免疫接種方法。 優(yōu)點(diǎn)： 免疫效果好； 缺點(diǎn)： 操作困難，易損傷接種魚類，幼魚無法使用 。 2. 口服法： 將疫苗通過投喂的方法接種到魚類機(jī)體 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單； 缺點(diǎn)： 免疫效果不穩(wěn)定（因消化液對(duì)疫苗的消化分解） 3. 浸泡法： 將魚類浸泡于疫苗溶液中以達(dá)到免疫接種目的 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單； 缺點(diǎn)： 免疫效果不穩(wěn)定（因浸泡進(jìn)入機(jī)體的疫苗數(shù)量有限） 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 4. 噴霧法： 將疫苗以高壓噴射到接種生物體表以進(jìn)行免疫的方法。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單； 缺點(diǎn)： 免疫效果差 。 5. 其他方法： 如超聲免疫法等，該法是在浸泡法基礎(chǔ)上外加超聲作用而實(shí)施的接種方法，目前尚在探索中。 （三）幾種常見魚類疫苗的制備方法 1. 病毒性疫苗（組織苗）的制備方法 勻漿 , 3000rpm,30min 上清液 +(800單位青霉素 +800單位鏈霉素 )/ml 病魚組織 +生理鹽水 沉淀 加 1‰ 福爾馬林， 32℃ 72h 安全檢測(cè) 冷凍保存 組織苗 效力檢測(cè) 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 2. 細(xì)菌滅活疫苗的制備方法 擴(kuò)大培養(yǎng) 5000rpm, 30min, PBS配制 病原菌 大量病菌 1%菌懸液 活菌檢測(cè) 安全檢測(cè) 410‰ 福爾馬林 毒性檢測(cè) 4℃ , 24h 疫苗 抗體效價(jià)檢測(cè) 免疫效果檢測(cè) ‰ 疊氮鈉 攻毒試驗(yàn) 4℃ 保存 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 3. 脂多糖 (LPS)疫苗的制備 (主要針對(duì) G) %formalin, 上清液 加 PBS 病菌擴(kuò)大培養(yǎng) 5000rpm, 30min 沉淀 滅活菌懸液 4℃ , 透析 3d 90%苯酚 (1:1) LPS水溶液 水層 65℃ , 10min 聚乙二醇 2022 中間層 混合液 苯酚層 10000rpm, 30min 濃縮 LPS溶液 冷凍干燥 粗制 LPS LPS疫苗 PBS溶解，加熱去毒 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 （四）魚類免疫應(yīng)答的過程 1. 硬骨魚類參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞和器官 1) 參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞： 巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞 2) 參與免疫反應(yīng)的器官： 胸腺、腎 (主要為頭腎 )、脾等。 2. 魚類免疫應(yīng)答的基本過程 識(shí)別 吞噬或胞飲，送至 抗原進(jìn)入機(jī)體 巨噬細(xì)胞 脾和腎等器官 吸收積累 產(chǎn)生 細(xì)胞免疫和體液免疫 淋巴細(xì)胞 抗原信息 增殖、產(chǎn)生 傳遞 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 3. 影響魚類免疫應(yīng)答的因素 1) 抗原方面的因素： 包括疫苗性質(zhì)、接種數(shù)量和接種方法等 2) 接種生物的因素： 包括年齡、大小、生理狀態(tài)、營養(yǎng)狀況等 3) 環(huán)境因素： 包括溫度、季節(jié)、光照及水質(zhì)環(huán)境因素等 4) 佐劑的影響： 有些佐劑能非特異性增強(qiáng)或改變疫苗免疫應(yīng)答效果。 （五）魚類免疫效果的檢測(cè)方法 1. 免疫保護(hù)效果檢測(cè)： 接種疫苗 ?(24周 )致病菌攻毒 ?(1020d)成活率 2. 免疫抗體效價(jià)檢測(cè)： 接種疫苗 ?(24周 )取血 ?(1000rpm, 5min)上清液 ?微量血凝板倍稀，加入抗原 (疫苗 ) ? (37℃ 反應(yīng) 2h后 4℃ 孵育過夜 ) 結(jié)果 凝集抗體效價(jià)的判斷： 出現(xiàn)凝集反應(yīng)的最低濃度的稀釋倍數(shù)就是其凝集 抗體效價(jià) 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 練習(xí)題： 1. 名詞解釋： 免疫、非特異性免疫、特異性免疫、抗原、抗體、佐劑、 抗原決定簇、血清學(xué)反應(yīng)、免疫學(xué)反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)、凝集反應(yīng)、 沉淀反應(yīng)、免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、多價(jià)疫苗、免疫標(biāo)記技術(shù) 2. 水產(chǎn)動(dòng)物免疫的種類及其功能如何？自動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫有哪些區(qū)別？ 3. 簡述水產(chǎn)動(dòng)物免疫的特點(diǎn)及在病害防治中的意義。 4. 水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫有哪些？它們各有什么主要作用？ ？作為抗體應(yīng)具備的條件有哪些？ 6. 血清學(xué)反應(yīng)有哪些特點(diǎn)？ 7. 免疫學(xué)原理在水產(chǎn)病害防治中有哪些方面的應(yīng)用？ 8. 主要的抗原抗體反應(yīng)和現(xiàn)代免疫標(biāo)記技術(shù)有哪些？ 9. 以雙抗體夾心法為例，簡述用 ELISA法檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病原的主要過程？ 10. 水產(chǎn)動(dòng)物疫苗分為哪些類型？它們各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？ 11. 魚用疫苗的接種方法有哪些？它們各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？ 12. 分別簡述水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疫苗、細(xì)菌性疫苗和 LPS疫苗的制備過程？ Chapter 2. 水產(chǎn)動(dòng)物免疫及其應(yīng)用