【正文】 的吸管/量筒分別由原來的 “10 ml吸管（或注射器）、10 ml吸管（或注射器）和25 ml吸管（或注射器）”相應(yīng)改為“5 ml吸管（或注射器）、5ml吸管（或注射器）和15ml吸管（或注射器）”，使其最大限度地接近一般原則的要求。QC部QC部QC部QC部QC部外源病毒檢驗(yàn)法1 樣品處理 取樣品 2～3 瓶。對毒種或活疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)時，將樣品混合，用相應(yīng)的特異性抗血清中和后作為檢品（另有規(guī)定除外） ；對細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)時，經(jīng) 3 次凍融后混合作為檢品；用雞檢查法檢驗(yàn)時，樣品不處理。如果對檢品中的病毒中和不完全， 可用效價更高的血清重做， 或用制品使用對象進(jìn)行檢驗(yàn)。2 禽源細(xì)胞及其制品和其他禽源制品的檢驗(yàn) 通常情況下，采用雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法進(jìn)行，如果檢驗(yàn)無結(jié)果或結(jié)果可疑時，用雞檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)。 選 9～11日齡 SPF 雞胚 20個，分成 2 組，第 1 組 10枚雞胚， ～ （如果為疫苗， 至少含 1～10羽份）， 第 2 組 10枚雞胚， 經(jīng)絨毛尿囊膜接種 ～ （如果為疫苗，至少含 1～10羽份），置 37 ℃下培養(yǎng) 7 日。棄去接種后 24小時內(nèi)死亡的雞胚，但每組雞胚應(yīng)至少存活 8 只，試驗(yàn)方可成立。 判定 胎兒應(yīng)發(fā)育正常，絨毛尿囊膜應(yīng)無病變。取雞胚液作血凝試驗(yàn)，應(yīng)為陰性。 細(xì)胞觀察 取 2 個已長成良好雞胚成纖維細(xì)胞單層的 （培養(yǎng) 24小時左右） 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（面積不小于 25cm 2），接種中和后的疫苗 （ 2～20羽份），培養(yǎng) 5～7 日，觀察細(xì)胞，應(yīng)不出現(xiàn) CPE 。 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) 取上述培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌細(xì)胞面 3 次，加入 % （ V/V ） 雞紅細(xì)胞懸液覆蓋細(xì)胞面， 置 2～8℃ 60 分鐘后， 用 PBS 輕輕洗滌細(xì)胞 1～2 次，在顯微鏡下檢查紅細(xì)胞吸附情況。應(yīng)不出現(xiàn)由外源病毒所致的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。 禽淋巴白血病病毒檢驗(yàn) COFAL 試驗(yàn)或 ELISA 試驗(yàn) 見附錄 30頁。 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒檢驗(yàn) 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA ） 見附錄 32頁。 用適于接種本疫苗日齡的 SPF 雞 20只，每只同時點(diǎn)眼、滴鼻接種 10羽份疫苗，肌肉注射 100 羽份疫苗， 21日后，按上述方法和劑量重復(fù)接種 1 次。第 1 次接種后 42日采血，進(jìn)行有關(guān)病原（表）的血清抗體檢測。在 42日內(nèi)，不應(yīng)有疫苗引起的局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡。 如果有死雞， 應(yīng)進(jìn)行病理學(xué)檢查， 以證明是否由疫苗所致。進(jìn)行血清抗體檢測時，除本疫苗所產(chǎn)生的特異性抗體外，不應(yīng)有其他病原的抗體存在。表 用雞檢查法檢驗(yàn)外源病毒時檢查的病原及其檢驗(yàn)方法__________________________________________________病 原 檢驗(yàn)方法 雞傳染性支氣管炎病毒 HI/ELISA雞新城疫病毒 HI禽腺病毒（有血凝性） HI禽 A 型流感病毒 AGP/HI雞傳染性喉氣管炎病毒 中和抗體 /ELISA禽呼腸孤病毒 AGP/ELISA雞傳染性法氏囊病病毒 AGP/ELISA禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒 IFA/ELISA雞馬立克氏病病毒 AGP禽淋巴白血病病毒 ELISA禽腦脊髓炎病毒 ELISA 雞痘病毒 AGP/ 臨床觀察3 非禽源細(xì)胞及其制品的檢驗(yàn) 細(xì)胞的選擇 每一種被檢樣品應(yīng)接種以下細(xì)胞： （ 1）綠猴腎（ Vero ）傳代細(xì)胞；（2）疫苗靶動物的胚胎細(xì)胞，或新生動物細(xì)胞，或細(xì)胞系。 樣品的接種與培養(yǎng) 至少 （疫苗制品至少含 10頭份）已處理被檢樣品應(yīng)接種到已長成良好單層的上述細(xì)胞，另至少設(shè)一瓶正常細(xì)胞對照， 每一種細(xì)胞總培養(yǎng)時間應(yīng)不少于 14日。培養(yǎng)期間細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)至少繼代 1 次。最后一次繼代的細(xì)胞單層數(shù)量和培養(yǎng)面積應(yīng)符合熒光抗體檢查法、致細(xì)胞病變檢查法和紅細(xì)胞吸附性外源病毒檢驗(yàn)的要求。 判定 在至少 14日的培養(yǎng)期內(nèi)， 要對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)檢查， 如果培養(yǎng)期間出現(xiàn)細(xì)胞病變， 則判為不符合規(guī)定。 如無細(xì)胞病變，培養(yǎng)結(jié)束時，細(xì)胞單層應(yīng)按 進(jìn)行檢驗(yàn)。 熒光抗體檢查法 最后一次繼代的細(xì)胞單層應(yīng)培養(yǎng) 5～7 日后用于熒光抗體檢查。對每一種特定外源病毒的檢驗(yàn)應(yīng)至少包含三組細(xì)胞單層：（1）被檢樣品細(xì)胞培養(yǎng)物；（2）在最后一次繼代時接種 100 ～300FAID 50特定病毒的陽性對照；（3）正常細(xì)胞對照。每一組細(xì)胞單層檢查面積應(yīng)不小于 2。每一種細(xì)胞應(yīng)按下列規(guī)定選擇特異的抗病毒熒光抗體（另有規(guī)定除外）。（1）所有細(xì)胞均應(yīng)檢驗(yàn)：牛病毒性腹瀉病毒（ BVDV ）。（2）豬源細(xì)胞：豬細(xì)小病毒（ PPV ）、豬瘟病毒（CSFV ）。（3）牛、綿羊和山羊細(xì)胞：藍(lán)舌病病毒（ BTV ）。（4）犬源細(xì)胞：狂犬病病毒（ RV ）、犬細(xì)小病毒（CPV ）。（5）馬源細(xì)胞：馬傳染性貧血病毒。細(xì)胞單層樣品經(jīng)丙酮固定后， 用適宜的熒光抗體進(jìn)行染色， 檢查每一組單層是否存在特定外源病毒的熒光。 當(dāng)陽性對照出現(xiàn)特異熒光， 正常細(xì)胞無熒光時， 如果被檢樣品出現(xiàn)外源性病毒特異性熒光， 判為不合格。 如果陽性對照組熒光不明顯， 或者正常細(xì)胞出現(xiàn)不明顯熒光，判為無結(jié)果，應(yīng)重檢。 致細(xì)胞病變檢查法 取經(jīng)傳代后培養(yǎng)至少 7 日的敏感細(xì)胞單層（ 2）進(jìn)行檢驗(yàn)。用適宜染色液對細(xì)胞單層進(jìn)行染色。觀察細(xì)胞單層，檢查包涵體、巨細(xì)胞或其他由外源病毒引起的 CPE 的出現(xiàn)情況。如果出現(xiàn)外源病毒所致的特異性 CPE ，判為不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗(yàn)排除這種可能性時，則判為不合格。 紅細(xì)胞吸附性外源病毒檢驗(yàn) 取經(jīng)傳代后至少培養(yǎng) 7 日的細(xì)胞單層（ 2）進(jìn)行檢驗(yàn)。以 PBS 洗滌細(xì)胞單層 2～3 次。加入適量 % 的豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞的等量混合懸液， 以覆蓋整個單層表面為準(zhǔn)， 紅細(xì)胞懸液可在加入前混合， 亦可分別滴加于不同的細(xì)胞單層上。 選 2 個細(xì)胞單層， 分別在 2～8℃和 20 ～25 ℃放置 30分鐘， 用 PBS 洗滌，檢查紅細(xì)胞吸附情況。 如果出現(xiàn)外源病毒所致的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象， 判為不合格； 如果疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗(yàn)排除這種可能性時，則判為不合格。3305外源病毒檢驗(yàn)法 1禽源制品及其細(xì)胞的檢驗(yàn)除另有規(guī)定外，禽源制品及其細(xì)胞的檢驗(yàn)按照下列方法進(jìn)行。通常情況下，可采用雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法進(jìn)行，如果檢驗(yàn)無結(jié)果或結(jié)果可疑時，用雞檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)。也可直接用雞檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)。 樣品處理 取樣品至少2瓶。對種毒按所生產(chǎn)疫苗推薦羽份稀釋，對活疫苗按瓶簽注明羽份后，混合，用相應(yīng)的特異性抗血清中和后作為檢品（除另有規(guī)定除外），如待檢疫苗毒在檢驗(yàn)用細(xì)胞上不增值，可不進(jìn)行中和；對細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)時，經(jīng)3次凍融后混合作為檢品；用雞檢查法檢驗(yàn)時，樣品不處理。 雞胚檢查法 選9～11日齡SPF雞胚20個，分成2組，第1組10枚雞胚，～ ml（除另有規(guī)定外，至少含10羽份），第2組10枚雞胚，～ ml（除另有規(guī)定外，至少含10羽份），置37℃ 下培養(yǎng)7日。棄去接種后24小時內(nèi)死亡的雞胚，但每組雞胚應(yīng)至少存活8只，試驗(yàn)方可成立。 判定 胎兒應(yīng)發(fā)育正常，絨毛尿囊膜應(yīng)無病變。取雞胚液作血凝試驗(yàn)，應(yīng)為陰性。 細(xì)胞檢查法 細(xì)胞觀察 取2個已長成良好雞胚成纖維細(xì)胞單層的（培養(yǎng)24小時左右）細(xì)胞培養(yǎng)瓶（面積不小于25 cm2），~ ml（2～20 羽份），培養(yǎng)5～7日，觀察細(xì)胞，應(yīng)不出現(xiàn)CPE。 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) 取上述培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞面3次，％（V/V）雞紅細(xì)胞懸液覆蓋細(xì)胞面，置2～8℃ 60分鐘后，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞1～2次，在顯微鏡下檢查紅細(xì)胞吸附情況。應(yīng)不出現(xiàn)由外源病毒所致的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。 禽淋巴白血病病毒檢驗(yàn) 采用COFAL試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn) 具體方法見附錄3302。 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒檢驗(yàn) 采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）進(jìn)行，具體方法見附錄3304。 雞檢查法 除另有規(guī)定外，用適于接種本疫苗日齡的SPF雞20只，每只同時點(diǎn)眼、滴鼻接種10 羽份疫苗，肌肉注射100 羽份疫苗，21日后，按上述方法和劑量重復(fù)接種1次。第1次接種后42日采血，進(jìn)行有關(guān)病原（見下表）的血清抗體檢測。在42日內(nèi)，不應(yīng)有疫苗引起的局部或全身癥狀或死亡。如果有死亡，應(yīng)進(jìn)行病理學(xué)檢查，以證明是否由疫苗所致。進(jìn)行血清抗體檢測時，除本疫苗所產(chǎn)生的特異性抗體外，不應(yīng)有其他病原的抗體存在。表 用雞檢查法檢驗(yàn)外源病毒時檢查的病原及其檢驗(yàn)方法病原檢驗(yàn)方法雞傳染性支氣管炎病毒HI/ELISA雞新城疫病毒HI禽腺病毒（有血凝性）HI禽A型流感病毒AGP/HI雞傳染性喉氣管炎病毒中和抗體/ELISA禽呼腸孤病毒AGP/ELISA雞傳染性法氏囊病病毒AGP/ELISA禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒IFA/ELISA雞馬立克氏病病毒AGP禽淋巴白血病病毒ELISA禽腦脊髓炎病毒ELISA雞痘病毒AGP/臨床觀察2 非禽源細(xì)胞及其制品的檢驗(yàn)除另有規(guī)定外，非禽源制品及其細(xì)胞的檢驗(yàn)按照下列方法進(jìn)行。 樣品處理 活疫苗 除另有規(guī)定除外，取至少2瓶樣品，按瓶簽注明頭份稀釋、混合，以2000~3000g離心10分鐘，取上清液，用相應(yīng)的特異性抗血清中和后作為檢品。待檢疫苗毒在檢驗(yàn)用細(xì)胞上不增殖的，可不進(jìn)行中和。 毒種 除另有規(guī)定外，取至少2支（瓶）毒種原液（凍干制品恢復(fù)至凍干前裝量即為原液），按所生產(chǎn)的疫苗推薦頭份稀釋后，混合，2000g~3000g離心10分鐘，取上清液，用相應(yīng)的特異性抗體血清中和后為檢品。如待檢病毒在檢驗(yàn)細(xì)胞上不增殖，可不進(jìn)行中和。 細(xì)胞 經(jīng)3次凍融后， 2000g~3000 g離心10分鐘，取上清液作為檢品，無需進(jìn)行中和。 細(xì)胞的選擇與樣品的培養(yǎng) 細(xì)胞的選擇（應(yīng)至少包括下列細(xì)胞） 豬用活疫苗、毒種和細(xì)胞檢查用細(xì)胞 致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附性檢查采用的細(xì)胞：Vero細(xì)胞、PK15細(xì)胞（或ST細(xì)胞）。 熒光抗體檢查用細(xì)胞：檢查牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV、MDV）采用MDBK（或牛睪丸）細(xì)胞；檢查豬瘟病毒(CSFV)用PK15（或ST）細(xì)胞；檢查豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）用PK15細(xì)胞。 牛用活疫苗、毒種和細(xì)胞檢查用細(xì)胞 致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附性檢查采細(xì)胞：Vero細(xì)胞、羊睪丸（或羊腎）細(xì)胞。 熒光抗體檢查牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV/MDV）或用MDBK（或牛睪丸）細(xì)胞。、毒種和細(xì)胞檢查用細(xì)胞：Vero細(xì)胞、羊睪丸（或羊腎）細(xì)胞（BVDV/MDV）或用MDBK（或牛睪丸）細(xì)胞。 犬科、貓科或鼬科動物用活疫苗、種毒和細(xì)胞檢查采用的細(xì)胞 致細(xì)胞病變檢查和紅細(xì)胞吸附性檢查采用的細(xì)胞：Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK（或F81）細(xì)胞。 熒光抗體檢查采用的細(xì)胞：檢查牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV/MDV）用MDBK（或牛睪丸）細(xì)胞；檢查狂犬病病毒（RV）采用Vero（或BHK21）細(xì)胞；檢查犬細(xì)小病毒（CPV）采用CRFK（或F81）細(xì)胞。、毒種和細(xì)胞檢查用細(xì)胞：檢查牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒（BVDV/MDV）用MDBK（或牛睪丸）細(xì)胞。（除另有規(guī)定外，至少含10頭份。如10頭份不能被完全中和，應(yīng)至少含1頭份），接種已長成良好的單層（或同步接種）的所選細(xì)胞上，另至少設(shè)一瓶正常細(xì)胞對照，培養(yǎng)3~5日，繼代至少2代。最后一次繼代（至少為第3代）的培養(yǎng)物作為外源病毒檢驗(yàn)的被檢材料。如樣品傳代培養(yǎng)期間，任何一代培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，而正常的細(xì)胞未出現(xiàn)病變，則判為不符合規(guī)定。當(dāng)被檢樣品判定不符合規(guī)定時，可不再進(jìn)行其他項(xiàng)目檢驗(yàn)。 將最后一次繼代（至少為第3代）的培養(yǎng)物培養(yǎng)3~5日，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，至少觀察6cm2的細(xì)胞面積。若未觀察到明顯的細(xì)胞病變，再用適宜染色液對細(xì)胞單層進(jìn)行染色。觀察細(xì)胞單層，檢查包涵體、巨細(xì)胞或其他由外源病毒引起的 CPE 的出現(xiàn)情況。當(dāng)正常對照細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，而被檢樣品出現(xiàn)外源病毒所致的CPE，則判為不符合規(guī)定。當(dāng)致細(xì)胞病變檢查法檢查結(jié)果判為不符合規(guī)定時，可不再進(jìn)行其他項(xiàng)目的檢驗(yàn)。 將最后一次繼代（至少為第3代）的培養(yǎng)物培養(yǎng)3~5日后直接進(jìn)行檢驗(yàn)。以PBS洗滌細(xì)胞單層2～3次。%的豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞的等量混合懸液以覆蓋整個單層表面為準(zhǔn)。選2個細(xì)胞單層，分別在2～8℃和20～25℃放置30分鐘，用PBS洗滌，檢查紅細(xì)胞吸附情況。當(dāng)正常對照細(xì)胞不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，而被檢樣品出現(xiàn)外源病毒所致的紅細(xì)胞吸