【正文】 22r/min，離心 5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 9. 向上清加入 2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置 510分鐘， 12022r/min離心 5分鐘。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒 DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。 20ulTE緩沖液，其中含有 20ul/ml的胰RNA酶，使 DNA完全溶解， 20攝氏度保存。 （二）對提取的質(zhì)粒 DNA進行純化： 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒 DNA，采用膠回收試劑盒純化質(zhì)粒 DNA。 【 實驗安排 】 本實驗一天內(nèi)可做完。實驗結(jié)果可結(jié)合下一個實驗一起觀察。 實驗七 PCR擴增目的基因片段 【 實驗?zāi)康?】 1. 通過本實驗學習 PCR反應(yīng)的基本原理。 2. 了解擴增過程中各因素對擴增結(jié)果的影響。 3. 掌握 PCR的基本操作。 【 實驗原理 】 多聚酶鏈式反應(yīng)（ polymerase chain reaction, PCR）的原理類似于 DNA的天然復(fù)制過程。在待擴增的 DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增 2n倍。 1. 變性：加熱使模板 DNA在高溫下（ 94 ℃ ）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。 2. 退火：使溶液降溫至 50～ 60 ℃ ，模板 DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，即退火階段。 3. 延伸：溶液溫度升至 72 ℃ ，耐熱 DNA聚合酶以單鏈 DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的 4種脫氧核苷三磷酸（ dNTP） ,按照 5’→3’ 方向復(fù)制出互補 DNA，即引物的延伸階段。 上述 3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸 3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的 DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過 25～ 30個循環(huán)后 DNA可擴增106～ 109倍。 典型的 PCR反應(yīng)體系由如下組分組成： DNA模板、反應(yīng)緩沖液、 dNTP、 MgCl兩個合成的 DNA引物、耐熱 Taq DNA聚合酶。 【 儀器、材料與試劑 】 （一）儀器 1. PCR熱循環(huán)儀 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 3. 臺式離心機 4. 微量移液器 5. 微波爐 （二）材料 1. 模板 DNA 2. 上游 primer1 和下游 primer2 （三）試劑 1. PCR反應(yīng)物： Taq DNA聚合酶， 4種 dNTP混 合液（ mmol/L）。 2. 5 溴酚藍上樣緩沖液。 3. 50 TBE電泳緩沖液： Tris 242 g，乙酸 mL， (pH )100ml，加水到1000ml，高壓滅菌后備用。 【 實驗步驟 】 1. 分別在兩個滅菌的 ，按加樣表的順序加樣（整個加樣過程 TaqDNA聚合酶放于冰中保持低溫），建立50181。L反應(yīng)體系。 成分 體積 終濃度 10 PCR buffer 5 181。L 1 dNTP（ 4種混合物） 5 181。L 每種 10 181。mol/L primer 1(上游 ) 181。L 181。mol/L 10 181。mol/L primer 2(下游 ) 181。mol/L 模板 DNA 1 181。L～ 10 181。L ～ 1 181。g Taq DNA聚合酶 181。L ddH2O 至 50 181。L 2. 在 PCR儀上設(shè)置如下程序進行擴增 ① 94 ℃ 預(yù)變性 5min； ② 94 ℃ 變性 1min； ③ 54 ℃ 退火 1min； ④ 72 ℃ 延伸 1min； ⑤ 重復(fù)步驟②～④，約 3035次； ⑥ 72 ℃ 延伸 10min； ⑦ 20 ℃ 保溫 1min。 3. 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR結(jié)果 取 2～3 181。L反應(yīng)液及 1181。L 上樣緩沖液混合，進行電泳，選擇適當大小的 DNA分子量標準，檢查擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)束后， EB染色 15min，紫外燈下觀察實驗結(jié)果，必要時拍照。 【 注意事項 】 1. PCR是建立在一定量的模板和與之專一性互補配對的一對引物之上的，因此，在進行 PCR之前，模板的純化和引物設(shè)計尤為重要。 2. Mg2+ 對 TaqDNA聚合酶的活性影響很大，有時按照試劑商提供的說明擴增不出目的基因時，不妨適當增加 Mg2+的濃度。 3. 模板和引物的濃度要適量，并不是越多越好，否則，會出現(xiàn)非特異條帶。 【 思考題 】 ？ Tm值？有何用途？如何計算？ ？ 實驗八 酶聯(lián)免疫吸附實驗 【 實驗?zāi)康?】 掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的一般原理，掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的基本操作及其在生物樣品測定中的應(yīng)用。 【 實驗原理 】 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA）是本世紀 60年代末期發(fā)展起來的一種免疫檢測方法，是目前最廣泛應(yīng)用的標記免疫技術(shù)。 ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。 3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）； ②酶標記的抗原或抗體（標記物）； ③酶作用的底物（顯色劑）。 ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體 , 再加 相應(yīng)酶標記抗體，生成抗原 待測抗體 酶標記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。 【 儀器、材料與試劑 】 1. 儀器設(shè)備 酶聯(lián)免疫檢測儀 (Bio－ 550)；酶標板 (96孔 )；微量注射器。 2. 試劑 (1)HRP標記羊抗兔 Ig G(1:1 000，國產(chǎn) )；標準牛 IgG；兔抗牛血清（ 1:256）； (2)包被液： , 4℃ ，保存 , Na2CO3 , NaHCO3 ,蒸餾水稀釋至 100 mL。 (3)稀釋液與洗滌液： Tween20, ４ ℃ ，保存。 NaCl 8g, KH2PO4 , Na2HPO412H2O , Tween— 20， 。蒸餾水加至 1000mＬ。 (4)封閉液：含 %明膠 ， 。 (5)鄰苯二胺底物溶液 (臨用前配制 )：臨用前將Na2HPO412H2O ,檸檬酸 100mL蒸餾水中 , 再加入 40mgOPD， 40μL30%H2O2。 (6)終止液： 2mol/LH2SO4。于 500mL蒸餾水中加入 98%濃硫酸 76mL混均即可。 【 實驗步驟 】 1. 將抗原結(jié)合在酶標板上 。 取標準 IgG（ 10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋 ， 得到濃度為 液 ， 每孔加人 100μL抗原包被液 ， 并以不加標準抗原的兩孔為對照 ， 為反應(yīng)的 0%值 ， 將反應(yīng)板于 4℃ 過夜 （ 8個樣品 ， 分 3個平行 ， 4個 100%值孔；共 28+2孔 ） 。 2. 標準牛 IgG與初級抗體一兔抗牛血清的反應(yīng) 。 將標準 IgG（ 10mg/mL） 用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標準牛 IgG（ 4μg/mL至 ） 各200μL， 加到入 32倍稀釋好的 200μL的兔抗牛血清中 ，其中 4個不加標準牛 IgG作為測量時的 100%值 。 4℃ 反應(yīng)過夜 。 3. 封閉板。將包被好的酶標板孔內(nèi)液體傾去，進行洗滌，各孔加 200μL洗滌液后室溫下放置 1min，倒掉，如此重復(fù) 4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進行封閉，在 37℃ 放置 45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。 4. 向酶標板中加人標準抗原和抗體的混合物。將標準牛 IgG和兔抗牛血清的混合物取 100μL加入到酶標板孔內(nèi)，同是 4個未加抗原的 100%值的平行樣也加入酶標板中。 37℃ 放置 2h，再洗板 4次。 5. 加人 HRP標記的羊抗兔 Ig G。洗滌后每孔加100μL稀釋好的 HRP羊抗兔 IgG， 37℃ 放置 1h，洗滌。 6. 加人 OPD底物。洗板 4次后，每孔加入 100μL底物溶液，于 37℃ 暗處反應(yīng) 20min后，每孔加入 50μL結(jié)束反應(yīng)液以終止反應(yīng)。 7. 吸收測定。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為 492 nm下的吸光值。 8. 數(shù)據(jù)處理。標準曲線是以 Ig(標準牛 IgG含量 )對B/Bo作圖，求得線性方程。其中， C為標準牛 IgG含量；B為不同濃度標準牛 IgG吸收值與 0%吸收值之差 。 Bo為 100吸收值與 0%吸收值之差。 B/B0 酶聯(lián)吸附測定標準牛 IgG標準曲線 y = + R2 = 10120 1標準牛IgG含量對數(shù)值【 注意事項 】 1. 使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。加樣前應(yīng)使溶液充分混勻，并將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出現(xiàn)氣泡。 2. 為避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)，可用封板膠將 ELISA板面密封后進行溫育。 3. 每次洗板的液體殘留量不宜過多，洗完后，應(yīng)將微孔板在吸水紙上輕輕拍干。