研實(shí)驗(yàn)大實(shí)驗(yàn)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-01 22:13本頁(yè)面
【正文】 之間，檢查玻璃底是否漏水；如果漏水 ,要重裝。 用小燒杯按下表 1配下層膠（分離膠），膠濃度 13％，混勻，灌膠，高度離梳子約 1～ ，然后覆蓋一層水，凝膠時(shí)間為 1530分鐘，膠與水分層，傾倒去水。 小燒杯按上表配上層膠（濃縮膠），膠濃度５％，混勻，灌膠，插入梳子； 在凝膠過(guò)程中，液面下降，要補(bǔ)充膠液，凝膠時(shí)間約1020分，凝好膠，拔掉梳子； 加入稀釋的電極緩沖液 ,浸泡至上槽（低玻璃面） ,但不能高過(guò)下槽（低玻璃面） ,注意不能漏水。 封膠 分離膠 13% 濃縮膠 5% 凝膠貯液 30%（ mL） 2 上層膠緩沖液 （ mL） 0 0 下層膠緩沖液 （ mL） 0 0 10％ TEMED（四甲基乙二胺）（ μL） 200 50 100 水（ mL） 6 5％明膠 (μL) 0 100 AP（過(guò)硫酸氨）（ μL） 100 100 100 總體積（ mL） 凝膠時(shí)間 （ 5min凝膠） （ 1520min凝膠） （ 10min凝膠） （二）、電泳的過(guò)程 點(diǎn)樣前，樣品要加 20％蔗糖 20ul以增加比重，同時(shí)加％的溴酚蘭 10ul指示劑，按下表 2點(diǎn)樣，用微量注射器點(diǎn)樣 ，每點(diǎn) 1個(gè)樣品，都要清洗微量注射器，注意不要交叉污染。 將電泳槽上槽（低玻璃面）接（－），下槽（高玻璃面）接（＋）， 恒電壓電泳： 濃縮膠， 100V ，約 1h ；分離膠， 160V ，約 34h。指示劑離下面膠剩1cm左右停止電泳。 剝膠。注意，不要把膠弄碎。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 名稱(chēng) 鹽析 過(guò)柱 1 標(biāo)準(zhǔn) 過(guò)柱 2 過(guò)柱 3 體積（ ul） 10 10 10 10 10 （三）、電泳后的活性染色 電泳完畢，取出膠板置于培養(yǎng)皿中，用去離子水沖洗數(shù)次，將膠板浸在含 mg/mL胰蛋白酶， ， 37℃ 下保溫酶解 30min。 室溫下用水漂洗酶解過(guò)的膠板 5次 。 漂洗完畢，用考馬斯亮藍(lán) R250 50℃ 染色 ，用 5%氨水于搖床上進(jìn)行脫色 5min至背景清晰 ,到掉氨水，用水洗干凈氨水。 把膠置于照相板上進(jìn)行拍照。 八 注意事項(xiàng) ? 凡士林不要涂太多。 ? 封好底加水檢測(cè)是不是漏水，漏水重做。 ? 加分離膠后記得加入一層水，但不要沖歪了分離膠。 ? 點(diǎn)樣時(shí)，樣品記得加入蔗糖，增加比重。 ? 可置于 4℃ 冰箱電泳。 ? 開(kāi)始時(shí)可以加大電壓量（ 100左右），使樣品加快進(jìn)入分離膠，進(jìn)入分離膠后控制在 80～ 140之間，或者電流在 20～ 40之間，注意不要電流過(guò)大，使玻璃板裂開(kāi)。 ? 電泳時(shí)間示情況而定，溴酚藍(lán)不要跑過(guò)頭，約 2～ 3h。 ? 酶解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則輪廓較模糊。 九 . 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 ，區(qū)別蛋白酶抑制劑的各成分，并做好標(biāo)記。 ，是否是分離純化蛋白酶抑制劑的較好的方法，如果不是，是否還有更好的快速鑒定方法，請(qǐng)說(shuō)明之。 。 。 （本實(shí)驗(yàn)由巫光宏老師編寫(xiě)）
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