生化實驗ppt課件-資料下載頁
2025-05-01 13:01本頁面
【正文】 ? 重組 DNA分子沒有甲基化－選用限制系統(tǒng)即酶缺陷型菌株。防止重組 DNA被菌體內(nèi)酶降解 ? 轉(zhuǎn)化的是雙鏈 DNA， ?吸附在細胞表面的是雙鏈 DNA，但以單鏈 DNA進入細胞。 ?只有閉環(huán) DNA（ CC）與開環(huán) DNA（ OC）的轉(zhuǎn)化，才能獲得轉(zhuǎn)化子，用線性質(zhì)粒 DNA（ L）進行轉(zhuǎn)化不能得到轉(zhuǎn)化子 ?DNA分子轉(zhuǎn)化的復雜過程如下：①吸附 —— 完整的雙鏈 DNA分子吸附在受體菌的表面。②轉(zhuǎn)入 —— 雙鏈DNA分子解鏈。單鏈 DNA進入受體菌，另一鏈降解。③自穩(wěn) —— 外源質(zhì)粒 DNA分子在細胞內(nèi)又復制成雙鏈環(huán)狀 DNA。④表達 —— 供體基因隨同復制子同時復制，并被轉(zhuǎn)錄、翻譯。 ?。 １：大腸桿菌在 LB平板上劃線培養(yǎng) 1216小時，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)大腸桿菌到對數(shù)期 (37℃ 200RPM 3 4小時，如從冰箱中保存平板中挑取的菌落，則到對數(shù)期時間可能要到67小時 ) ２：取 1ml培養(yǎng)物 7000rpm,離心 ，冰浴放置 ３：用預冷的氯化鈣懸浮菌體， 7000rpm,離心 菌體，冰浴放置（可不離心，直接倒掉） ４：用預冷的氯化鈣 1ml懸浮菌體，冰浴， 7000rpm,離心，冰浴放置 ５：加入 200μ l預冷氯化鈣，放置于冰浴，即得感受態(tài)細胞 ,此細胞可現(xiàn)用 ,也可在 4℃ 保存 1周，或分裝于無菌離心管中 ,投入液氮 ,快速冷凍然后儲于 70℃ 保存 注意：在本操作流程的前幾步中，每次離心后，應盡量將上清液去除干凈，以防 LB培養(yǎng)基的污染 現(xiàn)制感受態(tài)細胞可直接使用 。 b:凍存感受態(tài)細胞在手心緩慢融化 . 2: 加入待轉(zhuǎn)化外源 DNA(40ng左右 )，冰浴30min。 3:42℃ 熱沖擊 1分 30秒 4：冰浴 5min 5：加入 1mlLB液體培養(yǎng)基， 37℃ 保溫 45分鐘－ 1小時。 6：取 20－ 200ul菌懸浮液，涂布于有選擇壓力的 LB培養(yǎng)基上（本實驗中為 100ug/ml的安卞青霉素培養(yǎng)基），３７ ℃ 保溫過夜。 溫浴后加菌液到培養(yǎng)基上同時加入4ulIPTG,20ulXgal(如用蘭白斑篩選） 轉(zhuǎn)化效率每 ugDNA經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化所能形成菌落的總數(shù)。 將 1ug/ul質(zhì)粒 1:100稀釋 ,1ul用于 100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用 LB稀釋到 1000ul后，用 100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生 1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù) /鋪板 DNA的總量。 1000克隆 X10ng /1 ng DNA（轉(zhuǎn)化用） /ug=106cfu/ ug 氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將 β －內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍區(qū)域中的抗生 Ehrlich(1979)曾表明細胞可以于４ ℃ 在 CaCl2溶液中保存 2448小時，在貯存的最初 1224小時內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平 轉(zhuǎn)化效率影響因素 待轉(zhuǎn)化 DNA的濃度、純度、構(gòu)型 感受態(tài)細胞 活細胞數(shù)不應超過 108細胞 ml 轉(zhuǎn)化條件
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