【正文】 理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。 ? 造成變性的因素 如 加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。 ?變性的本質(zhì) 破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的 一級結(jié)構(gòu)。 ?變性后蛋白質(zhì)的特征 處于伸展狀態(tài) ， 溶解度降低 ， 易酶解 ， 分子的不對稱性增加 。 ? 應用舉例 ?臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。 ?此外，防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 若蛋白質(zhì)變性程度較輕 ， 去除變性因素后 ， 蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和功能 ， 稱為 復性 (renaturation) 。 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 * 蛋白質(zhì)沉淀 在一定條件下 ， 蛋白質(zhì)疏水側(cè)鏈暴露在外 ， 肽鏈會 相互纏繞繼而聚集 ， 因而從溶液中析出 。 變性的蛋白質(zhì) 易于沉淀 ， 有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀 ， 但并不變性 。 可分為兩種類型： 可逆性沉淀作用：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后 ， 用透析等方法除去 沉淀劑 ， 可使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶 液中 。 不可逆性沉淀作用：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后 ， 不能用透析等方法 除去沉淀劑使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶 液中 。 主要沉淀因素及機理： 無機鹽類：如硫酸銨 ， 破壞其雙電層 ， 使蛋白質(zhì)失去 電荷而析出 。 重金屬鹽類：在堿性條件下 ， 蛋白質(zhì)帶負電荷 ， 可以 與重金屬離子結(jié)合 ， 形成不溶性重金屬 蛋白鹽沉淀 ， 如醋酸鉛 、 硫酸銅等 。 有機溶劑：破壞水化層 ， 使蛋白質(zhì)分子間靜電作用增 加而聚焦沉淀 ， 如乙醇 、 丙酮等 。 生物堿試劑：在酸性條件下 ， 蛋白質(zhì)帶正電荷 ， 與生 物堿試劑結(jié)合形成溶解度極小的鹽類 ， 如三氯乙酸 、 單寧酸等 。 （四）蛋白質(zhì)的含量測定方法 （ 1) 紫外吸收法 （ 2） 考馬斯亮藍 G250法 （ 3） Folin法 （五）蛋白質(zhì)的呈色反應 ⒈ 茚三酮反應 (ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。 ⒉ 雙縮脲反應 (biuret reaction) 蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。 雙縮脲反應 蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應，產(chǎn)生紅紫色絡合物 紅紫色絡合物 (鹼性溶液 ) Cu2+ 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 （ 一 ） 、 一般步驟 材料的預處理 破碎細胞 蛋白質(zhì)的粗提 （ 與雜質(zhì)分開 ） 將蛋白質(zhì)沉淀出來 （ 等電點 、 鹽析法 、 有機溶劑法 ） 粗制品的純化 （ 凝膠過濾法 、 纖維素柱 色譜法 、 親和層系法 ） Protein Purification Selection of a protein source Homogenization and solubilization Ammonium sulfate precipitation Dialysis Further purification Ultracentrifugation Electrophoresis Chromatography （二）、蛋白質(zhì)的純化方法 （ 1）透析及超濾法 * 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 * 超濾法 應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 （ 2）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用 丙酮沉淀 時 ， 必須在 0～ 4℃ 低溫下進行 ，丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積 。 蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后 ， 應立即分離 。 除了丙酮以外 ， 也可用乙醇沉淀 。 *鹽析 (salt precipitation)是將硫酸銨 、 硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液 ， 使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞 ， 導致蛋白質(zhì)沉淀 。 * 免疫沉淀法： 將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 （ 3）電泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負極移動 。 這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術 , 稱為 電泳 (electrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 *等電聚焦電泳 ，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 *雙向凝膠電泳 是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術。 Native PAGE SDSPAGE （ 4）層析 層析 (chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的 。 蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 ? 離子交換層析： 利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。 ? 凝膠過濾 (gel filtration)又稱分子篩層析， 利用 各 蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 ? 親和色譜法原理 ：是根據(jù)許多蛋白質(zhì)對特定的化學基團具有專一性結(jié)合的原理，將配基顆粒裝入一定規(guī)格的玻璃管中制成親和柱，當?shù)鞍踪|(zhì)溶液經(jīng)過時，與之特異結(jié)合到柱上，不能結(jié)合者就洗脫下來，然后采用一定的 pH和離子強度的洗脫條件，將與配基結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)洗脫下來達到純化的目的。 Gel filtration chromatography Ion exchange chromatography Affinity chromatography （ 5）超速離心 * 超速離心法 (ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量 。 *蛋白質(zhì)在離心場中的行為用 沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示 ， 沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關 。 Ultracentrifugation 因為沉降系數(shù) S大體上和分子量成正比關系 ， 故可應用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量 ， 但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用 。 三、蛋白質(zhì)分子量測定方法 ：分子量對數(shù)對洗脫體積作圖 ， 并用標準分子量蛋白質(zhì)作對照 ， 從圖中就可以查得未知蛋白質(zhì)的分子量 。 ： 電泳：帶電顆粒在電場中向著與之所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象 。 在電場中移動的速度與其所帶電荷 、 大小 、形狀等均有關系 。 電泳載體：丙烯酰胺 （ Acrylamide， 簡稱 ACE） 為單體 ， 以N， N亞甲基雙丙烯酰胺 （ Bis） 為交連劑 ， 有柱狀和垂直狀兩種 。 Native PAGE SDSPAGE *為什么可用 SDSPAGE電泳來測定蛋白質(zhì)的分子量 ？ SDS的加入 → 使蛋白質(zhì)變性 → 兩者結(jié)合 （ 1g蛋白質(zhì)結(jié)合 SDS） → 使之復合物帶大量負電荷 ，遠遠掩蓋了蛋白質(zhì)本身所帶電荷量和種類 ， 因此在電荷中由于與 SDS結(jié)合全部帶負電荷 ， 因此遷移速率只與分子量有關 ， 以分子量對遷移率作圖成線性關系 ， 以標準分子量蛋白質(zhì)作對照 ， 通過遷移率查得分子量 。 ： 若某一蛋白質(zhì)中某一特定成分含量為 x%， 且該組分只有一份 ， 則 最低分子量 = 原子量 （ 分子量 ） ? 100 /x aa殘基的平均分子量為 110,用蛋白質(zhì)分子量除以 110， 可粗略估計出其 aa殘基數(shù) ， 在解題時常常遇到這一常數(shù) 。 如何鑒定蛋白質(zhì)是否純化？ 不同 pH下電泳 ， 都為一條帶； 等電聚焦電泳也為一條帶； 保存完整的生物活性； 沉降速度一致 。 問答題和計算題 為什麼說蛋白質(zhì)是生命活動最重要的物質(zhì)基礎 ？ 試比較 Gly、 Pro與其它常見氨基酸結(jié)構(gòu)的異同 ， 它們對多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的形成有何影響 ？ 試舉例說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關系 （ 包括一級結(jié)構(gòu) 、 高級結(jié)構(gòu)與功能的關系 ） 。 為什么說蛋白質(zhì)水溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體 ？ 什麼是蛋白質(zhì)的變性 ？ 變性的機制是什麼 ？ 舉例說明蛋白質(zhì)變性在實踐中的應用 。 已知某蛋白質(zhì)的多肽鏈的一些節(jié)段是 ?螺旋 ， 而另一些節(jié)段是 ?折疊 。 該蛋白質(zhì)的分子量為 240 000， 其分子長 ?105,求分子中 ?螺旋和 ?折疊的百分率 。 (蛋白質(zhì)中一個氨基酸的平均分子量為 120) 名詞解釋 等電點 （ pI） 肽鍵和肽鏈 肽平面及二面角 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)變性與復性 分子病 肽