elisa實(shí)驗(yàn)ppt課件-資料下載頁
2025-01-06 14:07本頁面
【正文】 減弱，至 2小時(shí)后即可完全消退至無色。 比色 拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 結(jié)果以光密度（ oplical density， OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（ absorbence， A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于 A字母的右下角，如 OPD的吸收波長為492nm，表示方法為 A492nm或 OD492nm。 酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀 ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 ，準(zhǔn)確性為 177。 1%，重復(fù)性達(dá) %。 操作時(shí)室溫宜在 1530℃ ，使用前先預(yù)熱儀器 1530分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀 A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用 492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測(cè)讀。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。 6 結(jié)果判斷 定性測(cè)定 定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出 “ 有 ” 或 “ 無 ” 的回答，分別用 “陽性 ” 、 “ 陰性 ” 表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。 定量測(cè)定 ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法 ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈 S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。 4. ELISA的操作要點(diǎn) 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證 ELISA必要條件。 嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。 主要試劑 抗原：卵白蛋白溶液 20ug/ml(以包被緩沖液稀釋 ) 待檢血清：兔抗卵白蛋白（以封閉液倍比稀釋） 酶標(biāo)抗體：酶標(biāo)羊抗兔 IgG(1:1000封閉液稀釋 ) 包被緩沖液： 洗滌液： %Tween20緩沖液 封閉液： %明膠 %Tween20緩沖液 底物溶解液： 枸櫞酸鹽緩沖液 底物液： %鄰苯二胺 (OPD),臨用前加 30%H2O2 150ul/100ml 終止液： 2MH2SO4 實(shí)驗(yàn)步驟 待檢血清的稀釋： 第一孔： + 第 28孔： + 血清濃度： 1:10— 1:108 1. 包被：包被液（ 20ug/ml卵白蛋白） 200ul/孔 2. 洗滌： %Tween20 3min/次， 洗滌 3次 。 3. 加待測(cè)血清： %明膠 PBSTween20稀釋血清100ul/孔 ：同上 5. 加酶標(biāo)抗體：以封閉液 1:500稀釋， 100ul/孔 6. 洗滌：同上 包被液為 4℃ 過夜或 37℃ 2h 37°C, 45’ 37°C, 45’ 8. 終止反應(yīng)： 2MH2SO4 25ul/孔 9. 檢測(cè) : 酶標(biāo)儀 492nm測(cè) OD值 室溫避光 5min ： OPD100ul/孔 實(shí)驗(yàn)步驟
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